제품 설명

유전자 발현을 억제하는 하나의 방법으로 RNA 간섭 작용 (RNA interference; RNAi)이 있다. RNAi는 이중 가닥 RNA를 도입하여 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 방법이다. 포유류 세포에서는 21 ~ 23 염기의 짧은 이중 가닥 RNA (short interfering RNA; siRNA)에 의해 RNAi 효과를 얻을 것으로 밝혀지고 있다. RNAi 실험의 주요 방법으로는 합성 siRNA를 도입하는 방법과 발현 벡터를 이용하여 세포 내에서 siRNA를 형성시키는 방법이 있다. 합성 siRNA는 그 RNAi 효과가 일시적이다 발현 벡터를 이용하면 RNAi 효과의 지속을 기대할 수 있다. 특히 발현 벡터를 사용하여 안정 도입 세포를 획득하면 장기간에 걸쳐 유전자의 발현 억제가 가능하게 된다. 레트로 바이러스 벡터는 목적 유전자를 감염 세포 염색체에 안정적으로 통합할 수 있기 때문에 목적 유전자의 장기 안정 발현 벡터로 아주 효과적이다.pSINsi-DK I는 2개의 shRNA(short hairpin RNA)를 각각 hU6 프로모터와 hH1 프로모터로부터 발현시킨다.
pSINsi-DK II는 2개의 shRNA를 각각 hU6 프로모터와 mU6 프로모터로부터 발현시킨다. 어느 벡터도 동등하게 shRNA를 발현해, 2개의 유전자의 동시 넉다운이나 하나의 유전자에 대한 넉다운 효과의 증강에 이용할 수 있다. 마커 유전자로서는 네오마이신 내성 유전자를 탑재하고 있다.
본 제품은 이미 절단되어 있으며, 벡터 본체와 프로모터 카셋트로 구성되어 있다.

내용

pSINsi-DK I DNA Set（제품코드 3663）

pSINsi-DK Vector（linearized)	3 μg（0.1 μg/μl）
DK I Promoter Cassette^*1	2.1 μg（35 ng/μl）

pSINsi-DK II DNA Set（제품코드 3664）

pSINsi-DK Vector（linearized)	3 μg（0.1 μg/μl）
DK II Promoter Cassette^*2	3.3 μg（55 ng/μl）

^*1 human U6 promoter（Accession； X07425）와 human H1 promoter（ Accesson；S68670）를 탑재
^*2 human U6 promoter（Accession； X07425）와 mouse U6 promoter（Accesson；X06980）를 탑재

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원리

shRNA를 발현시키기 위한 2 종류의 두 가닥 합성 올리고 DNA와 벡터 본체, 프로모터 카세트 4 개의 조각을 동시에 라이게이션하므로써 단번에 벡터를 구축할 수있다. 이 4조각 라이게션에는 DNA Ligation Kit (제품 코드 6023)가 유효 (밑그림).

그림 4조각 라이게이션

얻은 plasmid를 이용하여 일시적 트랜스펙션을 통해 쉽게 더블 넉다운 레트로 바이러스 벡터를 획득할 수있다. 이 일시적인 바이러스 생산은 Retrovirus Packaging Kit Eco 또는 Ampho (제품 코드 6160/6161)와 293T 세포, 293 세포를 이용하여 효율적으로 실시할 수 있다. 일시적 얻은 재조합 레트로 바이러스를 표적 세포에 감염시켜 G418 함유 배지에서 선택 배양하여 유전자 도입 세포를 획득할 수 있다. pSINsi 벡터 시리즈의 레트로바이러스 벡터는 핵외에서는 3'LTR U3영역의 프로모터 활성이 되지 않는다. 따라서 역전사 후 염색체에 포함된 프로 바이러스 상태에서는 5'LTR의 프로모터 활성이 소실되어 프로 바이러스 유래의 mRNA는 전사 되지 않게 되어 있다. pol III계의 프로모터로부터의 헤어핀형 RNA와 SV40 프로모터로부터의 네오마이신 내성 유전자만이 전사 된다. 발현한 헤이핀형 RNA는 세포내의 Dicer에 의한 분해를 받아 siRNA가 된다. 2 개의 유전자를 동시에 Knock-down 하거나 1 개의 유전자에 대한 RNAi 효과가 증강 세포를 획득하는 것이 가능하다.

2개의 유전자 동시 knock-down 이용방법

벡터 및 DK I, DK II 카세트 DNA sequence data

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