- 쉽고 빠른 고감도의 quantitative enzymatic assay
- Blotting 불필요
- N-말단과 C-말단 fusion vectors를 모두 이용 가능한 경제적인 vector 세트
- 대형 실험에 적용가능
단백질의 기능이 밝혀지지 않았다 하더라도 ProLabel Kit는 화학발광 (Chemiluminescent)을 이용하여 고감도로 목적 재조합 단백질의 발현을 검출하고 측정할 수 있다 (Figure 1; 1). Clontech의 ProLabel Quantitative Expression Vector Set를 이용하면 N-말단과 C-말단 ProLabel 융합 단백질 모두를 발현시킬 수 있다. 또한, ProLabel Chemiluminescent Detection Kit와 함께 사용하면 정제되지 않은 세포 용해 산물에서도 ProLabel 융합 단백질의 발현을 쉽고 빠르게 그리고 직접적으로 측정할 수 있다. 이 제품은 RNA interference (RNAi) 연구의 단백질 knockdown을 검출하기 위해 제작되었지만, 모든 ProLabel 융합 단백질 검출 실험에도 사용할 수 있다.
ProLabel Kit의 적용 실험 :
- 목적 단백질의 발현 관찰과 정량 (Figure 1).
- 면역침전법 (coimmunoprecipitation)으로 단백질간의 상호작용 검출(Figure 2)
- RNAi 연구에서 shRNA나 siRNA로 단백질 knockdown 평가 (Figure 3).
- HTS assay
- 실험자의 실험에 맞춰 다양하게 적용 가능
ProLabel 검출법의 원리
ProLabel 검출법은 상보적인 2 개의 효소 단편에 기반을 두고 있다 (2, 3). ProLabel tag은 비활성형 단편을 coding 하며, 목적 단백질과 융합되어 N-말단 tag 또는 C-말단 tag로 발현된다 (Figure 1). ProLabel 융합 단백질은 Enzyme Acceptor (EA) (Detection Kit에서 제공)와 결합하면, 화학발광 기질을 절단할 수 있는 완전하게 활성화된 효소를 형성한다. 검출과 정량은 일반적인 luminometer로 가능하다. 이 실험법은 넓은 분석 범위 뿐만 아니라 낮은 검출한계와 다양한 검출 범위로 목적 단백질 발현 변화를 쉽게 측정할 수 있다.
ProLabel system의 특징
- ProLabel tag는 작다 (6 kDa).
- 단독으로 발현된 tag는 빠르게 분해되기 때문에 background 발현이 낮다.
- 정제하지 않은 세포 용해물로 실험이 가능하기 때문에 쉽고 빠르게 데이터를 얻을 수 있다.
- ProLabel system은 high-throughput 실험에도 쉽게 적용 가능하다.
Figure 1. The ProLabel Screening Kit allows you to quantitatively measure the level of any recombinant protein. The ProLabel tag and Enzyme Acceptor(EA) combine to form an active enzyme that cleaves the chemiluminescent substrate; the resulting signal can be detected with any standard luminometer.
Figure 2. Use ProLabel to quantify protein coimmunoprecipitation. Protein complexes formed between SV40 T and p53 (which strongly interact), and SV40 T and lamin (which do not specifically interact) were analyzed by immunoprecipitation. In both instances, SV40 T was tagged with ProLabel, while p53 and lamin were each fused to AcGFP1. The fusion proteins were coexpressed in HEK 293 cells and then complexes were immunoprecipitated from cell lysates using an anti-AcGFP1 antibody. Coimmunoprecipitation was indicated by increased chemiluminescence, as measured by our ProLabel Chemiluminescent Detection Kit. SV40 T = SV40 large T antigen. Lam = lamin. (1, 3)
Figure 3. ProLabel assays allow you to measure protein knockdown. HEK 293 cells were cotransfected with individual shRNA expression cassettes (generated with our Knockout RNAi Clone & Confirm Kits) and their respective target protein-ProLabel constructs. Knockdown efficiency was determined using the ProLabel Chemiluminescent Detection Kit (1).
Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
References
1. Chemiluminescent Quantification of ProteinExpression (July 2007) Clontechniques XXII(3): 18-19
2. Eglen, R. M. & Singh, R. (2003) Comb. Chem. High Throughput Screen. 6(4):381-387.
3. Eglen, R. M. (November 2002) Assay Drug Dev. Technol. 1(1 Pt 1):97-104.
4. Matchmaker Chemiluminescent Co-IP System. (October 2006) Clontechniques XXI(3):15-17.