Lenti-X와 Retro-X qRT-PCR Titration Kit는 바이러스 용액의 역가를 측정 하기 위한 매우 빠르고 간단한 방법이다. 본 Kit는 간단하게 RNA 정제를 실시한 후 qRT-PCR과 SYBR 기술을 이용하여 viral genome의 양을 측정한다. 일반적인 역가 측정 방법이 10 일 정도 소요되는 반면, 역가 측정 kit를 이용하면 단지 4 시간 만에 측정이 가능하며 HIV-1 계열 lentiviral vector 뿐만 아니라 MMLV 계열 retroiviral vector (pMSCV vector 제외)에도 이용할 수 있다.
qRT-PCR을 이용하면 바이러스 농축과 목적 세포 감염 단계 사이의 시간적인 간격을 극적으로 단축시킬 수 있기 때문에, 바이러스 농축부터 목적 세포 감염까지를 같은 날에 수행 할 수 있다 (Figure 1). 실험 지연으로 인한 바이러스 감염 능력의 저하를 방지하고 MOI (multiplicity of infection)에 따른 일관성 있는 세포 감염 결과를 얻을 수 있다.
qRT-PCR 역가 측정 방법
본 제품은 One-Step qRT-PCR을 이용하여 시료와 control RNA (kit에 제공)를 serial dilution하고, 희석된 시료의 copy수를 standard curve의 Ct 값과 비교하여 간단하게 역가를 결정할 수 있다. 제품은 200 회의 qRT-PCR 반응을 수행할 수 있는 반응 시약과 발현되어지는 서열 (cDNA나 shRNA)과 상관없이 HIV-1기반의 lentivirus 또는 MMLV 기반의 retroivirus vector 양쪽 모두에 사용할 수 있는 역가 측정용 primer set로 구성되어 있다. Vector가 다양해도 기본 골격 구조가 동일하여 검출방법이나 selectable marker를 변경하지 않고도 한번에 역가를 측정할 수 있으며, viral RNA 정제와 DNaseI 처리 단계를 통하여 잔존 가능성이 있는 plasmid DNA를 제거하여 일시적 transfection으로부터 생성된 바이러스들을 최소한의 시료를 사용하여도 정확하게 정량할 수가 있다.
Lentiviral p24 Titration Kit
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit는 바이러스 상층액내에 존재하는 p24 capsid 단백질의 잔존량을 측정하는 특이성 높은 ELISA법을 이용한다. p24의 양은 바이러스 역가와 직접적 상관관계가 있다. 용해된 바이러스 시료를 antip24 capture antibody로 코팅된 96-well plate (12 개의 8-well strip으로 분리 가능)에 넣고, 세척 후 결합된 p24는 biotinylated anti-p24 2차 항체와streptavidin-HRP, 발색 시약을 첨가하여 측정한다. p24 control을 이용하여 표준 곡선을 만들고, p24를 동량으로 조정하고 상층액의 역가를 산출한다.
Figure 1. Flowchart of the procedures used for titrating viral supernatants with Clontech's qRT-PCR virus titration kits.
Figure 2. Schematic of the Lenti-X p24 Rapid Titer Procedure. p24 from the culture supernatant is lysed and bound to anti-p24 coated wells and detected using a combination of biotinylated anti-p24 secondary antibody, streptavidin-HRP, and a color reagent.
Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
References
1. Kustikova, O. S. et al. (2003) Blood 102(12):3934-3937. 2. Tseng, W. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(41):25641-25647. 3. Sastry, L. et al. (2002) Gene Ther. 9(17):1155-1162. 4. Rapid Lentiviral & Retroviral Titration Kits (January 2008) Clontechniques XXII(1):1-3.