제품 설명
SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing은 illumina사의 차세대 시퀀서(next-generation sequencing；NGS)를 이용한 유전자 발현 해석에 적합하도록 디자인된 cDNA조제 Kit이다. 불과100 pg의total RNA로부터 Illumina's Genome Analyzer, HiSeq™와 HiScanSQ™ 시스템에 이용 가능한 cDNA을 조제할 수 있다. 조제된cDNA는, illumina사의 독자적인Sequencing By Synthesis (SBS)법에 사용하는 Library 제작 프로토콜에 곧바로 이용할 수 있다.

RNA-Seq(RNA Sequencing) 해석은 지금까지의 유전자 발현 해석과 비교해선 훨씬 적은 양의 RNA로 해석을 실시할 수 있지만 매우 소량의 시료의 경우엔 여전히 해석이 어려운 경우가 있었다. 그러나 본 제품과 illumina사의NGS시스템을 이용하면 생검(biopsy) 재료나 단일 세포 레벨과 같이 지극히 미량의 샘플로부터도 고감도로 재현성이 있는 유전자 발현 해석을 실시할 수 있다.


Figure 1. Overview of the sample preparation process for sequencing.

Success Story

“We have found the SMARTer Ultra Low RNA protocol and kit to be scientifically enabling, allowing us to ask questions about the nature of gene expression in individual cells that was not previously possible. The ability to assay the expression of individual neurons from brain slices, which we have done, allows one to correlate changes in the electrophysiology of each cell to changes in gene expression.”

James Knowles, M.D., Ph.D., Zilkha Neurogenetic Institute Keck School of Medicine, USC
SMART technology
SMART(Switching Mechanism At 5＇End of RNA Template) 기술은 단일 실험 단계 만으로 full-length의cDNA를 합성할 수 있는 Clontech의 독자적인 기술이다. 유전자의 증폭전의 존재비를 유지한 채로 full-length cDNA를 증폭시킬 수 있다. SMARTer Ultra Low RNA Kit은 SMART(er) Kit의 프로토콜을 illumina사의NGS시스템에 적합하도록 최적화시켰으며 이를 통해 미량의 RNA로부터도 NGS해석용 library 조제를 위해 충분한cDNA를 조제할 수 있다(그림1).



Figure 2. Electropherogram of amplified SMARTer cDNA.
Various amounts of Universal Human Reference Total RNA (UHR) and Human Brain Reference RNA were used as input for SMART cDNA synthesis. The cDNA samples were then analyzed for purity and yield on an Agilent 2100 Bioanalyzer. Shown are Bioanalyzer trace overlays of cDNA amplified from 1 ng (red line), 0.1 ng (dark blue line), 0.05 ng (green line), and 0.01 ng (light blue line) of total RNA and a no template control (NTC; pink line). The main peak indicates the purity and yield of cDNA between 0.4 and 9 kb-with the highest point at ~2 kb. There was no amplification in the negative control (pink line). Although the amount of input RNA can vary over quite a large range (e.g., 1 ng to 0.01 ng), comparable cDNA output can be obtained by adjusting the number of PCR cycles.
지극히 미량의RNA로부터NGS해석
SMARTer Ultra Low RNA Kit(은)는 샘플RNA양에 대해서 넓은 범위에 대해 높은 재현성을 나타낸다. illumina사의NGS기기를 이용했을 경우, 단일 세포 레벨과 같이 극히 미량의RNA로부터도 신뢰성이 높은 유전자 발현 해석을 실시할 수 있다. 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.01 ng의 mouse brain total RNA 를 이용해 library를 제작한 후 illumina사의GAIIx시스템으로 sequence를 해석하여 mouse genome상에 mapping을 실시했다(각 샘플에 대해 각각1개의 lane을 사용.~20 million reads/lane). 그 결과, 불과10 pg의RNA를 이용했던 실험에서도 sequence 데이터의90%이상을 genome상에 mapping 할 수 있었으며 transcript coverage율은 보다 많은RNA양을 이용했던 경우와 동등했다 ((표)1, 그림3).

Table I. Primary sequencing metrics from very small amounts of total RNA
Sequencing Metric 10 ng 1ng 0.1ng 0.05ng 0.01ng
% Mapping to Genome 97% 96% 95% 94% 92%
% Ribosomal RNA 4.3% 5.0% 3.8% 3.9% 3.9%
Number of Genes Detected 16,610 15,425 12,847 11,516 8,618



Figure 3. Comparison of transcript coverage with different amounts of input RNA
Shown are overlaid plots comparing the average read coverage from libraries made with 1 ng to 0.01 ng of mouse brain total RNA. The x-axis represents gene length normalized to 100%, where 0 is the 5’-end of each transcript and 100 is the 3’-end. The y-axis indicates the average coverage for a set of ~600 genes that are moderately to highly expressed in brain tissue. The results are very consistent through the range of input RNA used, with full-length coverage of the transcripts reflecting no systematic 5’- or 3’-bias.



Figure 4. Gene expression data obtained from very low amounts of RNA correlate well with data obtained by qPCR. Scatter plots were used to compare differential expression data obtained by sequencing with the SMARTer Ultra Low RNA Kit (1 ng total RNA) and quantitative PCR (qPCR) data available for Universal Human Reference Total RNA (UHR) and Human Brain Reference RNA through the MicroArray Quality Control (MAQC) project. The differential expression of ~700 genes showed correlation values of 0.94, demonstrating that the sequencing results are consistent with orthogonal gene expression technologies.
내용
보존
용도
illumina사의 NGS 시스템을 위한 RNA-Seq에 최적화된 cDNA 합성 (illumina 매뉴얼에 포함된 Kit)