본 제품은 특이성이 매우 높은 검출법인 Cycling Probe법을 이용하여 Real Time PCR로 Aldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) 유전자의 SNP를 식별하기 위한 probe/프라이머 set이다. ALDH2는 알콜의 중간대사물질인 아세트알데히드를 분해하는 효소로, exon 12에는 487Glu (GAA)→Lys (AAA)의 SNP[ALDH2 type 1 (wild type), ALDH2 type 2 (mutant type)]이 존재한다고 알려져 있다. 본 제품에는 프라이머, wild type 검출용 (ROX 표식)과 mutant type 검출용 (FAM 표식)의 2종류의 Cycling Probe 및 positive control이 포함되어 있으며 CycleavePCR Core Kit (TaKaRa Code CY501)와 함께 사용한다.
증폭과 검출에는 Real Time PCR 전용 기기 Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa Code TP800), Smart Cycler System, Smart CyclerⅡ System (TaKaRa Code SC200N)을 이용한다.
원리
본 키트는 Cycleave PCR Core 키트와 함께 사용한다. ALDH2의 SNP와 관련된 영역을 증폭함과 동시에 wild type, mutant type을 각각 검출하는 Cycling Probe의 형광 강도 변화를 실시간으로 검출함으로써 ALDH2를 typing한다.
PCR로 증폭된 ALDH2 fragment 중의 wild type 서열에 대해서는 wild type 검출용 probe가 hybrid를 형성하여 RNase H에 의해 RNA 부분이 절단되어 wild type 검출 probe의 표식물질(ROX)의 형광 강도가 증대된다. 한편 mutant type 검출용 probe는 RNase H에 의한 RNA 분해가 일어나지 않기 때문에 mutant
type 검출용 probe 표식물질 (FAM)의 형광 강도는 변하지 않는다. 마찬가지로 ALDH2 fragment 중의 mutant type 서열에 대해서는 mutant type 검출용 probe가 hybrid를 형성해 RNase H에 의해 RNA 부분이 절단되어 mutant type 검출용 probe 표식물질(FAM)의 형광 강도가 증대된다. Wild type 검출용 probe는 RNase H에 의한 RNA 분해가 일어나지 않기 때문에 wild type 검출용 probe 표식물질 (ROX)의 형광 강도는 변하지 않는다. 이처럼 Cycling Probe법에서는 하나의 염기 차이를 인식하여 RNase H에 의해 probe가 절단되어 각각의 형광강도 변화를 실시간으로 모니터함으로써 하나의 튜브에서 신속하게 typing 할 수 있다.