저분자RNA로부터 간편하고 효율적으로cDNA 합성
증폭한 cDNA는 곧바로 TA cloning 가능

제품 설명

세포에서 발현하는 RNA 중 단백질을 코드하지 않는 것이 많이 존재하고 그들이 중요한 기능을 가진 것으로 밝혀졌다. 이들은 기능성 RNA라는 명칭으로 분류되어 있고 그 중에서도 특히 18~26 염기 정도의 저분자 RNA (small RNA, miRNA)의 기능이 주목 받고 있다. 이 저분자 RNA의 기능은 아래와 같다.
(1) 유전자 발현을 mRNA 수준에서 억제
(2) 유전자 발현을 translation 수준에서 억제

저분자 RNA의 발현 해석하는 수단의 하나로 클로닝에 의한 해석이 있다. 저분자 RNA는 mRNA와같은 polyA tail이 없기 때문에 분리된 저분자 RNA의 5'과 3'말단에 RNA 또는 RNA/DNA chimera 어댑터를 결합시켜 역전사 반응 후, PCR로 증폭하여 클로닝하는 방법이 이용되고 있다. 본 키트는 위의 원리를 바탕으로 한 저분자 RNA의 클로닝용 cDNA 증폭 키트이다. 이 키트는 마그네틱 bead를 이용하여 복잡한 작업을 최대한 제외하고 간편한 조작으로 저분자 RNA 유래 cDNA를 증폭할 수 있도록 고안되었다. 증폭된 cDNA는 곧바로 TA 클로닝에 이용하는 것이 가능하다. 또한 어댑터에 있는 제한 효소 사이트를 이용하여 클로닝도 가능하다.

1. 조제한 small RNA에 BAP 처리하여 5'의 인산기를 제거한다.
2. BAP 처리한 RNA의 3'말단에 biotin화된 RNA/DNA chimera 어댑터를 결합시킨다.
3. Streptavidin 마그네틱 bead와 biotin화된 어댑터를 결합시켜 small RNA를 회수하여 T4 polynucleotide kinase로 5 '에 인산기를 추가한다.
4. 5'에 RNA/DNA chimera 어댑터를 결합시킨 후, RT-primer를 이용하여 역전사 효소(M-MLV4)로 역전사 반응을 수행한다.
5. cDNA를 bead에서 회수하여 PCR을 실시한다.
6. PCR단편 또는 제한 효소 처리 단편을 회수하여 클로닝한다.

제품구성

Package 1

1.	RNase Inhibitor	40 U/μl	50 μl
2.	10×BAP Buffer		200 μl
3.	Alkaline Phosphatase (BAP)		20 μl
4.	0.1% BSA	0.1%	60 μl
5.	3' adaptor ^{1, 2}		10 μl
6.	T4 RNA Ligation Buffer		600 μl
7.	T4 RNA Ligase	40 U/μl	20 μl
8.	5×T4 PNK Buffer		100 μl
9.	T4 Polynucleotide Kinase	10 U/μl	10 μl
10.	5' adaptor ^*1		10 μl
11.	5×RT Buffer		40 μl
12.	dNTP Mixture	각2.5 mM	90 μl
13.	PCR-R & RT-Primer ^{1, 3}	50 pmol/μl	20 μl
14.	M-MLV RTase (RNaseH free)	200 U/μl	10 μl
15.	2×PCR Buffer		250 μl
16.	PCR Primer F ^*1	50 pmol/μl	10 μl
17.	TaKaRa Ex Taq HS	5 U/μl	10 μl
18.	Control RNA ^*4	5 pmol/μl	10 μl

Package 2

19.	3 M Sodium Acetate (pH5.2)	200 μl
20.	Dr. GenTLE Precipitation Carrier ^*5	80 μl
21.	2×B/W Buffer	2.7 ml
22.	MAGNOTEX-SA	100 μl
23.	RNase-free dH2O	10 ml

^*1	3' adaptor,5' adaptor,PCR Primer F및PCR-R & RT-Primer에는,Sse8387 I의 사이트가 추가되어 있다. PCR산물과 벡터를Sse8387 I과Pst I 로 절단하여 라이게이션 할 수 있다. 본 키트에는 제한효소와 클로닝용 벡터 등은 포함되지 않기 때문에 별도로 준비 해야 한다.
^*2	3' adaptor는 biotin화 되어 있다.
^*3	PCR용reverse primer, 역전사 primer로 사용해도 된다.
^*4	Control RNA는 5’ 말단이 인산화된 21 mer RNA이다.
^*5	GenTLE Precipitation Carrier (code 9094)와 같은 제품이다.

보존

Package 1 : -20 ℃
Package 2： 4 ℃

키트 이외에 필요한 시약 및 기구류

[시약]

Phenol:chloroform:isoamylalcohol (25：24：1, v/v/v)
chloroform:isoamylalcohol (24:1, v/v)
에탄올
TE버퍼(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH8.0)
0.1 N NaOH
DNA size marker
20 bp DNA Ladder(code 3409)
RNA size marker
14-30 ssRNA Ladder Marker(code 3416)
10% polyacrylamide gel (미변성)
15% polyacrylamide gel (변성)
제한 효소Sse8387 I (Code 1183)
Cloning vector
Competent cell
라이게이션용 시약
DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(code 6023)
small RNA추출 시약

[기구]

마이크로 원심기
항온 수조(다음의 각 온도 설정으로 사용；히트블록 사용 가능)
15℃,25℃,37℃,42℃,70℃
마이크로 피펫트
마이크로 원심 튜브
Thermal cycler
PCR용0.2 ml튜브
필터 피펫트팁
Agarose gel 및 전기영동 장치
polyacrylamide 전기영동 장지
마그네틱 스탠드