iMatrix-511은 사람 다능성 줄기 세포를 장기간 배양 유지를 가능하게 한다고 보고되고 있는 laminin-511의 활성 부위만을 포함한 사람 재조합 laminin fragment이며(그림 1), 본 제품을 사용하면, 피더세포가 없는(feeder free) 조건 하에서 사람 다능성 줄기 세포를 배양할 수 있다.
또 사람 다능성 줄기 세포는 단일 세포 분산 조건하에서 미분화 상태를 유지하면서 생존하기 어려우므로, 확대 배양을 하려면 세포를 적당한 크기의 콜로니(세포 덩어리)로 해리시키는 숙련된 기술이 필요했다.
반면, iMatrix-511은 사람 다능성 줄기 세포에 대해 매우 강한 접착 활성을 가지므로, 하나(단일세포)의 사람 다능성 줄기 세포로도 배양기와의 접착성과 생존성을 높여 효율적으로 세포를 증식시킬 수 있다(그림 2, 그림 3). 또한 Matrigel을 이용한 경우와 마찬가지로 세포는 미분화 상태로 유지된다(그림 4). 본 제품을 이용하면 고품질의 균일한 사람 다능성 줄기 세포의 확대 배양이 가능하다.
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[간단 프로토콜] 본 제품을 정제수로 희석해 0.1~1.5μg/cm2* 되게 세포 배양기(Dish)에 첨가 *세포의 종류에 따라 최적 농도는 다르므로, 초기 조건 검토 시에는 0.5μg/cm2부터 시작하여 배양조건 최적화 ↓ 실온에서 3시간(혹은 4℃에서 하룻밤) incubation하고 용액 제거 ↓ 세포와 배양액을 넣어 세포 배양을 시작 |
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그림 1. 라미닌(whole laminin)과 iMatrix-511의 구조 비교
iMatrx-511은 라미닌의 α 사슬, β 사슬, γ 사슬의 C말단 영역으로 구성되며, 사람 다능성 줄기 세포에서 발현되는 α 6β 1 integrin과 높은 결합 활성을 나타낸다.
그림 2. 단일세포 및 콜로니의 iPS세포 생존율 비교
3×104개의 단일 세포 또는 콜로니를 파종(seeding)하고 6시간 후 부착 세포 수를 나타내었다. iMatrix-511은 파종 때의 세포 상태에 관계 없이 높은 접착성과 생존율을 보였다. 특히 단일 세포의 경우에는 Vitronectin이나 Matrigel과 비교해 그 차이가 크게 나타났다.
그림 3. 배양시간에 따른 iMatrix-511의 효과
각종 배양 자재에 따른 iPS세포(253G1) 세포의 증식성을 나타내었다. 7.5×104개의 단일 세포를 파종(seeding)하고 24, 48, 72시간 후에 세포 수를 비교하였다(비교를 위해 Matrigel/콜로니도 같이 실험). 24시간 후의 세포배양에서는 iMatrix-511을 이용한 단일 세포는 Matrigel과 비교하여 콜로니 형성률이 높고 세포 수도 많음을 확인했다. 또 72시간 후의 세포 수는 콜로니를 파종한 Matrigel과 동등하며, 원활한 세포 증식이 되고 있음을 확인하였다.
그림 4. 단일 세포 상태에서 미분화 상태 유지 확인(면역 염색)
iMatrix-511을 코팅한 dish에서 3회 계대한 iPS세포(253G1)에 대해 각종 분화/미분화 표지 검출 항체를 이용해 분화 상태를 확인했다. iMatrix-511에 의한 배양은 Matrigel과 마찬가지로 iPS세포를 미분화 상태로 유지하고 있었다.
※그림 3. 그림 4. 데이터는 iPS Academia Japan㈜ 에서 제공 받은 사람 iPS세포 253G1주를 사용하고 얻은 결과입니다.
<사람 iPS세포 253G1주의 참고 논문>
Nakagawa, M., Koyanagi, M et al. Nature Biotechnology, 2008 Jan;26(1):101-6.Epub 2007 Nov 30.