아래 사항을 고려하여 설계해야 한다.

• 일반적으로는 20∼25 mer의 primer가 적당하다(Size가 큰 PCR 산물을 증폭할 경우에는 25∼30 mer의 primer에서 좋은 결과가 나오는 경우가 있다). Forward primer와 reverse primer가 annealing하지 않도록 설계한다. 특히 3′말단에서 3염기 이상 상보적인 서열이 되지 않도록 주의한다.
• GC 함량이 50∼60%가 되도록 하고 부분적으로 GC 또는 AT rich가 되지 않도록 한다. 또한 template DNA와 안정적으로 annealing 할 수 있도록 primer의 3′말단은 AT rich가 되지 않도록 한다.
• Primer 내에서 2차 구조가 형성되는 것을 방지하기 위해 상보적인 서열을 포함하지 않도록 주의한다.
• Forward primer와 reverse primer의 Tm값의 차이가 커지지 않도록 설계한다.

※ Primer 설계용 소프트웨어 OLIGO™ primer analysis software와 primer 3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/) 을 이용하면 간단한 방법으로 정확성이 높은 primer를 설계할 수 있다.