ThruPLEX® DNA-Seq Kit을 이용한 출아효모의 DMS-Seq 분석 기법

Data kindly provided by: 이화학연구소(RIKEN), 마이크로바이옴 연구팀

◆ Introduction
Genome의 역할과 메커니즘을 포괄적으로 이해하기 위해서는 전사인자나 히스톤 등의 단백질이 DNA에 결합하는 위치를 규명해야 한다. 이러한 목적으로 이용되어 왔던 Genomic foot-printing 방식은 세포의 핵을 분리하고 DNA 분해효소를 처리해야만 했다. 이는 실험 조작이 어려울 뿐만 아니라 핵을 분리하는 과정에서 단백질과 DNA 상호작용이 변화되거나 또는 소실될 가능성이 있었다. 그리하여 본 연구실에서는 세포막 투과성 DNA 메틸화 시약인 디메틸황산 (dimethyl sulfate, DMS)를 이용하여 새로운 in vivo foot-printing 기법인 “DMS-Seq 기법”을 개발 중이다. DMS-Seq을 위한 프로토콜 정립을 위하여 ThruPLEX^® DNA-Seq Kit (Code 400674)를 이용하였다.

◆ 사용제품
ThruPLEX^® DNA-Seq Kit (Code 400674)

◆ Workflow (※)
① 출아효모 (Budding yeast)의 배양액을 회수하여 세포현탁액 (108 ~ 109) 1 ㎖을 2 ㎖ 튜브에 각각 분주

② 30 ㎕의 DMS를 첨가 후, 실온에서 2 min incubation

③ 800 ㎕의 in vivo STOP buffer를 첨가하여 반응을 중단시키고, washing buffer로 2회 washing

④ Zymolyase 처리 및 ProK/SDS를 처리하여 세포를 용해하고 phenol/chloroform 추출 및 에탄올 침전

⑤ RNase A 처리, phenol/chloroform 추출과 에탄올 침전

⑥ 12.5 ㎕ D.D.W를 첨가 후, 50 ng DMS 처리, DNA를 선별하여 Putrescine/APE1 처리

⑦ ThruPLEX^® DNA-Seq Kit (Code 400674)를 이용하여 NGS Library Preparation

⑧ Illumina^® MiSeq, 75 bp paired-end sequencing

⑨ Bowtie2 소프트웨어를 이용하여 Saccharomyces cerevisiae S288C(R64-1-1)에 mapping

※ 실험방법에 대한 자세한 내용은 아래의 논문을 참조하세요.
Umeyama, T. et al. DMS-Seq for In Vivo Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions and Nucleosome Centers. Cell Rep. 22, 289-300(2017)



◆ 기존의 분석 방법과 단편의 검출길이 비교
ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용함으로써 기존의 분석 방법으로는 NGS Library 제작이 불가능하였던 짧은 단편에 대한 NGS Library를 제작할 수 있었다.


◆ Integrative Genomics Viewer (IGV)를 이용한 피크 검출
Mapping 결과, ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용하였을 때 기존 분석방법에서 검출이 되지 않았던 peak가 주기적으로 나타나는 영역을 확인할 수 있다.


◆ 실험결과에 따른 연구자의 코멘트
ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용함으로써 기존 방법으로는 분석이 불가능하였던 양이 적고 짧은 단편의 서열을 분석할 수 있어 보다 포괄적인 분석을 진행할 수 있었다.