제품 설명
pBAsi 시리즈는 RNA polymerase III (pol III) 계의 프로모터를 탑재한 siRNA 발현 용 플라스미드 벡터이다.pol III 계의 promoter의 하류에 hairpin RNA를 발현 시키기 위한 합성 DNA 배열을 삽입하여 siRNA 발현 plasmid를 제작한다. 얻은 플라스미드는 세포에 도입하여 RNAi 실험에 사용할 수 있다. (그림 1) 또한 "promoter + hairpin형 RNA 서열"을 잘라 쉽게 아데노 바이러스 벡터에 실어 바꾸는 것도 가능하다. 재조합 아데노 바이러스의 제작에 관해서는 Adenovirus Dual Expression Kit (TaKaRa Code 6170)를 이용할 수 있다.



그림 1 Hairpin 형 RNA 발현 벡터
보관
－20℃
제한 효소 지도
pBAsi 벡터 시리즈는 3가지 종류의 다른 프로모터 플라스미드 벡터가 있습니다.

그림 2 pBAsi 벡터 시리즈의 제한 효소 지도
Hairpin RNA를 발현을 위한 DNA 합성
Hairpin형 RNA를 발현시키기 위해서 Ligation의 제한 효소 사이트 + 표적 서열(sence) + 루프 서열 + 표적 서열 (antisence) + 터미네이터 서열 + Ligation의 제한 효소 사이트를 차례로 디자인한 합성 DNA 를 promoter의 하류에 삽입한다. pBAsi 벡터 클로닝 사이트는 neomycin 내성 및 puromycin 내성의 경우 상류 측은 BamH I, 하류 측은 Xba I, Sse8387 I, Hind III 중 하나를 사용할 수 있다. 약제 내성 유전자를 포함하지 않는 pBAsi 벡터의 경우 위의 사이트뿐만 아니라 하류 Sal I, Acc I, Hinc II, Pst I, Sph I 사용 할 수 있다.
pol III 계 promoter의 전사 개시 점은 프린 염기 (G 또는 A)가 바람직한 때문에 표적 배열이 G 또는 A로 시작하지 않는 경우 표적 배열 전에 G 또는 A를 삽입한다.
루프 배열의 예로는 CTGTGAAGCCACAGATGGG (Boden et al. 참고 문헌 1)이 보고되었고 GTGTGCTGTCC (Miyagishi et al. 참고 문헌 2)도 유용하다는 것을 문헌을 통해 확인 되었다. 또한, 이외의 헤어핀 루프로 Lee et al (참고 문헌 3) Paddison et al (참고 문헌 4), Paul et al. (참고 자료 5), Sui et al (참고 문헌 6)들에 의해 각각 다른 서열이 보고 되고 있다.
터미네이터 배열은 TTTTTT 배열을 가진다. (T가 4 개 계속되면 pol III 계 모터에 의한 전사가 멈춘다). siRNA 서열 사용시 헤어핀 루프 배열 조합은 T가 4 개 이상 지속될 가능성이 있기 때문에 합성 DNA를 디자인 후 반드시 Top strand에 T가 4 개 이상 계속되지 않았는지 확인하는 것이 필요하다.

전사 시작점

BamH I　　↓

target sequence (sense)

Hairpin loop

target sequence (antisense)

Terminator

Hind III

Top strand

5'-GATCC(G/A)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

CTGTGAAGCCACAGATGGG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(C/T)

TTTTTT

A-3'

Bottom strand

3'-G(C/T)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

GACACTTCGGTGTCTACCC

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(G/A)

AAAAAA

TTCGA-5'


* 대상 배열의 첫 번째 염기가 G 또는 A 않으면 대상 배열의 전에 G 또는 A를 삽입할 수 있습니다.

Reference :
1) Brummelkamp et al. (2002) Science 296, 550-553
2) Lee et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 500-505
3) Paddison et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948-958
4) Paul et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508
5) Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520
6) Kawasaki et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 700-707
7) Tuschl, T., et al. (2003) Nat. Biotech. 20, 446-44
8) Shen, C., et al. (2003) FEBS Lett. 537, 111-114