제품 설명

본 제품은 T7 RNA Polymerase를 이용한 in vitro transcription 반응에 의해 대량의 단일 가닥 RNA를 합성하기 위한 kit이다. T7 RNA Polymerase는 T7 프로모터 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA를 주형으로 프로모터 하류의 서열을 전사하여 효율적으로 단일 가닥 RNA를 합성한다. 예를 들어, 20 ng의 Control Template (선형 플라스미드 DNA)를 주형으로 약 2 kb의 RNA를 합성하는 경우, 20 μl 반응 계에서 일반적으로 10 μg 정도의 RNA가 얻어진다. T7 프로모터 배열을 가진 plasmid를 선형하고 주형으로 사용할 수 있으며, T7 프로모터 서열을 부가한 PCR 산물과 합성 DNA도 주형으로 사용될 수 있다.
또한 이 제품은 RNase T1이 포함되어 있으며, in vitro transcription 반응으로 siRNA를 만들 수도 있다. 본 키트를 이용하여 siRNA를 제작하려면 먼저 T7 프로모터 서열을 부가한 siRNA 서열을 가지는 두 가닥 올리고 뉴클레오티드 (센스 사슬 용과 안티 센스 사슬)을 이용하여 각각의 튜브에서 센스사슬과 안티센스 사슬을 in vitro transcription 반응을 하여 동시에 RNA을 합성한다. 반응 종료 시 센스 사슬 안티센스 사슬은 annealing 시킨다. 다음 RNase free DNase I 와 RNase T1을 처리하여 주형 및 single strand RNA를 제거 한 후 siRNA를 정제하여 RNAi 실험에 사용한다.

내용

（20 μl반응、50회분)

10×Transcription Buffer		100 μl
T7 RNA Polymerase	50 U/μl	100 μl
RNase Inhibitor	40 U/μl	25 μl
ATP Solution	50 mM	100 μl
GTP Solution	50 mM	100 μl
CTP Solution	50 mM	100 μl
UTP Solution	50 mM	100 μl
RNase free DNase I	5 U/μl	200 μl
Control Template	50 ng/μl	20 μl
RNase T1	100 U/μl	25 μl
RNase T1 Dilution Buffer		700 μl
RNase free dH₂O		1 ml
10×Annealing Buffer^*		500 μl

^* siRNA 제작을위한 2 개의 oligonucleotide를 annealing 때 사용한다.
(조성; 100 mM Tris - HCl (pH8.0), 500 mM CH3COOK, 10 mM EDTA)

보관

-20℃

siRNA제작 개요

1) T7 프로모터 서열을 부가한 siRNA 서열을 가지는 두 가닥 올리고 뉴클레오티드를 2 세트 제작한다.

2) 제작 한 두 가닥 올리고 뉴클레오티드를 주형으로 한 개의 튜브에서 in vitro transcription 반응을 하고, 센스, 안티센스 각각의 RNA를 동시에 합성한다. 합성된 RNA는 annealing 시켜 dsRNA을 형성한다.

3) DNase I에 의한 주형 올리고 뉴클레오티드의 제거하고 RNase T1을 처리하여 단일 가닥 RNA 조각 (GGG)의 분해 한다.

4） 3 '말단 2 염기가 돌출하는 siRNA를 정제, 회수한다.