AAV는 다양한 혈청형이 존재하고 혈청형에 따라 host나 바이러스의 특징이 다른 것으로 알려져 있다. Serotype 2 (AAV2)는 오래전부터 널리 연구되어 온 serotype으로 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. Serotype 1 (AAV1), Serotype 5 (AAV5), Serotype 6 (AAV6)는 보다 조직 감염특이성을 가진 혈청형으로, AAV1은 근육, 간, 기도, 중추신경계 등에, AAV5 는 중추신경계, 간, 망막 등에, AAV6는 심장, 근육, 간 등에 대한 유전자 도입효율이 높다고 알려져 있다.
다카라에서는 Serotype 1, 2, 5, 6의 AAV vector를 helper virus없이 안전하게 제작하기 위한 AAVpro Helper Free System을 판매하고 있다. 본 제품으로 만들어진 AAV 바이러스 입자를 이용하여 표적 세포나 동물 개체에서 목적 유전자를 일시적으로 발현시킬 수 있다.
AAVpro® Helper Free System으로 AAV Particle 제작
AAVpro® Helper Free System은 helper virus를 사용하지 않고, 고역가의 AAV를 제작하는 시스템이다. 본 제품에 포함된 3종류의 플라스미드를 HEK293T 세포에 도입하여 간편하게 AAV입자를 제작할 수 있다.
- pAAV-CMV: CMV promoter와 목적유전자를 삽입하기 위한 MCS 및 2개의 ITR을 포함하는 vector plasmid
- pRC Vector: AAV2의 Rep 유전자와 각 serotype의 Cap 유전자를 포함하한 packaging plasmid
- pHelper: AAV를 생산하기 위해 필요한 adenovirus E2A, E4와 VA 유전자를 포함하는 packaging plasmid
기존에 동결/융해법 또는 초음파 파쇄법이 아닌 다카라에서 독자적으로 개발한 AAVpro® Extraction Solution을 이용하면 AAV producing cell로부터 숙주단백질이나 핵산의 혼입을 최소화하며, 간편하게 AAV vector입자를 추출할 수 있다. 추출시약은 System 제품내에 포함되어 있으며, AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)으로도 판매하고 있다.
또한 고효율의 in vivo 유전자 도입을 위한 AAV 정제에는 AAVpro® Purification Kit (All Serotype) (Code 6666) 또는 AAVpro® Purification Kit (AAV2)(Code 6232)를 이용할 수 있다.
그림 1. AAVpro® Helper Free System을 사용한 AAV 생산.
HEK293T cells에 세 종류의 plasmid (pHelper, pAAV-CMV, pRC2-mi342)를 co-transfection하면 recombinant AAV를 생산하는데 필요한 모든 단백질을 발현하게 된다. 이후 cell 안에서 packaging된 AAV는 AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)를 통해 추출할 수 있다.
그림 2. miRNA-342를 사용한 AAV2 system에서의 고역가 AAV 생산.
AAVpro® Helper Free System (AAV2)에 포함된 세 종류의 plasmid를 HEK293 cell에 co-transfection 하고, serotype 2의 AAV를 hsa-miR-342를 발현하는 cell (pRC2-mi342)과 발현하지 않는 cell (pRC2) 두 종류의 packaging cell에서 추출하였다. 이후 AAV의 titer를 qPCR을 사용해 측정한 결과 (e.g. AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233)) hsa-miR-342를 발현하는 경우, 발현하지 않는 경우 보다 2배 높은 역가의 AAV를 생산할 수 있었다.
그림 3. 각 system에 포함된 3종류의 plasmid map
(pRC2-mi342 vector는 Code 6230 제품에 포함된 vector입니다. 그외 다른 system에 포함된 vector는 상기 제품매뉴얼을 참고하세요.)
