TA-cloning과 제한효소를 이용한 cloning
1. Insert DNA (목적유전자) PCR
다카라에서는 클로닝 하고자 하는 유전자 즉, insert DNA의 염기서열 변이 (error) 없는 정확한 PCR을 위해 high fidelity PCR polymerase를 이용할 것을 추천한다. 아래에서는 매우 높은 정확도를 유지하면서도 뛰어난 신장성을 가지는 범용적인 high fidelity PCR 효소인 PrimeSTAR
® GXL DNA Polymerase (Code R050A)를 이용한 insert PCR 방법을 소개한다.
1) PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)를 이용하는 경우
① 아래의 mixture를 조제한다.
|
Volume |
Final conc. |
5X PrimeSTAR GXL Buffer |
10 ㎕ |
1X |
dNTP Mixture (2.5 mM each) |
4 ㎕ |
200 μM each |
primer 1 |
10 - 15 pmol |
0.2 - 0.3 μM* |
primer 2 |
10 - 15 pmol |
0.2 - 0.3 μM* |
Template |
5 ng - 500 ng*1 |
|
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase |
1 ㎕ |
1.25 U/50 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 50 ㎕ |
|
*1 Human genomic DNA 기준
② 아래의 반응조건으로 PCR 증폭한다.
98℃ |
10 sec |
30 cycles [3-step PCR] |
55 or 60℃*1 |
15 sec |
68℃ |
1 min/kb |
*1 Tm value 55℃ 이상일때는 60℃, 55℃ 이하일때는 55℃로 셋팅
(자세한 내용은 제품매뉴얼 참조)
2. PCR 산물 정제
PCR 반응이 끝난 후, 반드시 전기영동을 통해 증폭된 PCR 산물이 단일밴드임을 확인한 후 cloning 과정에 사용해야 한다. 단일 밴드를 확인한 후, PCR 반응액에 첨가되었던 다양한 component가 PCR 종료 후에도 반응액에 남아, 후속 실험의 방해요소로 작용할 수 있으므로, PCR fragment의 정제과정을 진행할 것을 추천한다. 이 때 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (Code 9761A) 또는 phenol/chloroform 추출 및 ethanol 침전으로 PCR 산물을 정제한 후 cloning 실험의 insert DNA로 사용한다.
만약 Primer dimer나 비특이적인 밴드가 증폭되는 경우에는 전기영동 후 agarose gel로부터 목적밴드를 회수하는 과정을 진행하며, 이 때, TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762)를 이용하면 잘라낸 agarose gel을 실온에서 빠르게 녹여 PCR 증폭산물을 회수할 수 있다.
3. PCR 증폭산물의 TA cloning
본 실험에 이용한 PimreSTAR
® GXL DNA Polymerase을 포함한 High fidelity PCR polymerase로 증폭된 PCR 산물은 3’말단에 deoxyadenosine (dA)가 부가되지 않으나, 간단한 반응을 통해 dA 염기를 부가한 후 TA-cloning에 이용할 수 있다.
1) Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR® (Code 6019)를 이용한 TA-cloning
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR
®(Code 6019)에 포함되어 있는 dA 부가효소를 이용하여 간단하게 dA염기를 부가하고 TA-cloning을 진행한다.
(1) 3’말단에 dA 부가
① 아래의 mixture를 조제한다.
정제한 DNA 용액 |
8 ㎕ |
10×buffer |
1 ㎕ |
dATP |
0.5 ㎕ |
A-overhang enzyme |
0.5 ㎕ |
Total |
10 ㎕ |
② 65℃에서 10 분간 반응한다.
③ 반응액을 제품내에 포함되어 있는 ligation 반응에 사용한다.
(2) (1)의 3’ overhang insert와 T-vector의 ligation
① 아래의 mixture를 조제한다.
(1)의 반응액 |
1 ㎕ *1 |
pMD20-T vector |
1 ㎕ |
Sterile distilled water |
3 ㎕ *1 |
Ligation Mighty Mix |
5 ㎕ |
Total |
10 ㎕ |
*1 PCR 산물 ((1)의 반응액)과 Sterile distilled water의 총량이 4 ㎕가 되도록 반응량 조절가능.
② 16℃에서 30 분간 반응한다.
2) Pol I형 DNA polymerase를 이용하여 dA 염기 부가 후 TA-cloning 하는 경우
TaKaRa Taq™ Polymerase (Code R001A) 등 Pol I 형 DNA polymerase의 3’말단 dA 부가 특성을 활용하여 매뉴얼방법으로 blunt end PCR product에 dA 염기를 부가한 후, T-vector와 고성능 ligation mix가 포함된 Mighty TA-cloning Kit (Code 6028)을 이용해 TA-cloning을 진행할 수도 있다.
(1) 3’말단에 dA 부가
① 아래의 mixture를 조제한다.
정제한 DNA 용액 |
7 ㎕ (이하) |
TaKaRa Taq™ Polymerase |
5 U |
10× PCR buffer |
1 ㎕ |
dATP* |
최종농도 0.2 mM |
Sterile distilled water |
Up to 10 ㎕ |
*dATP 별도구매 (Code 4026)
② 70 ℃에서 15-30분간 방치한다.
③ 이 반응액을 T vector와의 ligation 반응에 이용한다.
(2) (1)의 3’ overhang insert와 T-vector의 ligation
① 아래의 mixture를 조제한다.
(1)의 반응액 |
1 ㎕ *1 |
pMD20-T vector |
1 ㎕ |
Sterile distilled water |
3 ㎕ *1 |
Ligation Mighty Mix |
5 ㎕ |
Total |
10 ㎕ |
*1 PCR 산물 ((1)의 반응액)과 Sterile distilled water의 총량이 4 ㎕가 되도록 반응량 조절가능.
② 16℃에서 30 분간 반응한다.
4. E. coli 형질전환 (transformation)
16℃에서 30 분간 반응한 Ligation mixture를
E. coli에 형질전환 하기 위해 아래의 strain을 이용할 수 있다.
- Heat shock 용:
E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128)
E. coli DH5α Competent Cells (Code 9057)
- Electroporation용:
E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Code 9028),
E. coli DH5α Electro-Cells (Code 9027)
Electroporation을 실시하는 경우 ligation 반응액을 에탄올 침전 (필요에 따라 phenol/chloroform 추출 후 에탄올침전법 정제) 으로 정제한 후 형질 전환에 이용하는 것을 추천한다 (각 제조사 protocol 참조).
1) E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128) (이하 C.cells)을 이용한 형질전환
① 얼음위에서 C. cells을 녹인 후, 약하게 섞어 14 ml round-bottom tube (Falcon tube 등)로 옮긴다.
② 100 ㎕의 competent cell에 「2) 3'말단에 dA 부가 & TA cloning」 의 ligation 반응액 전량을 넣어준다.
③ 얼음위에서 30분간 방치한다.
④ 42℃, 45초간
*1 heat shock 후, 얼음 위에서 1~2분간 방치한다.
⑤ 최종 volume 1 ㎖가 되도록 제품내에 포함된 SOC medium (미리 37℃로 데워둔) 을 넣어준다.
⑥ 37℃에서 160 - 225 rpm으로 1시간 배양한다.
⑦ 적정량을 ampicillin, IPTG
*2, X-Gal
*2 가 포함되어 있는 LB plate 배지에 도말한 후 37℃에서 overnight 배양한다.
*1 1.5 ㎖ microcentrifuge tube를 이용하는 경우 42℃, 60초간 heat shock 한다.
*2 IPTG (Code 9030) 및 X-Gal (Code 9031) working solution 제작 및 plate 도말 방법
- IPTG: 0.238 g의 IPTG를 10 ㎖ sterile purified water에 녹여 (final conc. 100 mM), 필터링한 후 1 ㎖씩 분주하여 -20℃에 차광하여 보관한다. Plate (φ 9 cm 기준) 당 25 ㎕씩 도말하여 사용한다.
- X-Gal: dimethylformamide에 20 ㎎/㎖의 농도로 녹인 후 -20℃에 차광하여 보관한다. Plate (φ 9 cm 기준) 당 50 ㎕씩 도말하여 사용한다.
5. Insert 확인
pMD20-T vector 등 대부분의 T-vector의 MCS에는
LacZ 유전자를 포함하고 있어 insert가 정확히 ligation된 경우
LacZ 유전자가 깨지면서 형질전환된
E. coli가 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에서 white colony를 형성한다. 그렇지 않은 경우, 즉 insert가 제대로 삽입되지 않은 경우
LacZ 유전자가 발현하며 blue colony를 형성하게 된다. 따라서, Blue/White screening을 통해 white colony만을 선별한 후, 다양한 방법으로 insert 삽입여부를 확인할 수 있다.
1) EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Code RR310A)를 이용하여 colony PCR로 insert를 확인하는 경우
형질전환 후 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 생성된 white colony를 picking하여 PCR 주형으로 direct PCR을 진행할 수 있다. 이때에 Insert PCR시 사용했던 primer를 동일하게 이용하여 T-vector 내의 insert 삽입여부를 확인한다.
① 아래의 PCR mixture를 조제한다.
EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (2X Premix) |
25 ㎕ |
Forward primer*1 |
0.2 mM (final conc.) |
Reverse primer*1 |
0.2 mM (final conc.) |
Sterile distilled water |
Up to 50 ㎕*2 |
*1 Insert PCR에 사용했던 primer set를 그대로 사용
*2 농도에 비례하게 전체 volume 조절 가능
② ①의 mixture를 PCR tube에 50 ㎕씩 분주한다.
③ 하루동안 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에서 배양한 형질전환된
E. coli 중 white colony의 일부만 tip을 이용해 하나씩 picking 하여 mixture가 분주된 PCR tube에 넣고 조심스럽게 pipetting하여 colony 일부가 풀어 지도록 한다.
④ 아래의 반응조건으로 PCR 증폭한다.
98℃ |
10 sec |
30 cycles |
60℃*3 |
30 sec |
72℃ |
1 min/kb |
*3 Primer 조건에 따라 설정
⑤ PCR 반응이 끝나면 반응액을 전기영동하여 insert가 삽입된 clone을 확인한다.
⑥ Insert가 확인된 clone은 plate에 남아있는 colony의 일부를 다시 tip을 이용하여 약 1~4 ㎖의 LB 액체배지 (ampicillin 포함)에 접종한다.
⑦ 37℃ shaker에서 12~16시간 배양한 후 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)로 plasmid를 정제하여, insert sequence 확인을 위한 sequencing을 진행한다.
2) Recombinant plasmid DNA를 정제, 제한효소로 절단하여 확인
① 형질전환 후 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 생성된 white colony를 tip으로 picking하여 1~4 ㎖의 LB 액체배지 (ampicillin 포함)에 접종한 후, 37 ℃ shaker에서 12~16시간 배양한다.
② TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)를 이용하여 배양한
E.coli 로부터 plasmid를 정제한다.
③ pMD20-T vector의 MCS 에 포함된 제한효소 중 insert DNA를 절단하지 않는 제한효소 2종 (또는 insert에임의로 부여한 제한효소)을 선택해서 double digestion 한다.
- 제한효소 처리 예시
Plasmid DNA |
100~200 ng |
Hind III (Code 1060A) |
1~3 Unit |
Kpn I (Code 1068A) |
1~3 Unit |
10 x M buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕ |
*1Hind III와
Kpn I의 Double digestion시 추천하는 buffer (홈페이지 참조)
④ 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 전기영동 (loading buffer를 첨가)하여, insert 및 pMD20-T vector를 확인한다.
⑤ Insert가 확인된 clone은 sequencing을 진행하여 insert 염기서열을 확인한다.
위와 같은 방법으로 T vector에 목적 유전자가 삽입된 clone을 선별한 후, expression vector, viral vector, binary vector 등 최종적으로 사용할 vector에 sub-cloning을 진행하면 됩니다.