제한효소 처리 후 발현용 vector에의 sub-cloning
1. Expression vector 또는 최종 목적 vector 및 insert DNA 준비
1) Adeno-associated virus system (AAV2)의 viral vector 이용 시
Adeno-associated virus system을 이용하기 위해서는 목적유전자를 pAAV-CMV Vector에 cloning하여 293T cell에 다양한 packaging plasmid와 함께 co-transfection하여 AAV를 생산할 수 있다. pAAV-CMS vector MCS 상의 2가지 제한효소를 사용한 예시를 들어 sub-cloning 과정을 소개한다.
(그림. pAAV-CMV Vector map)
(1) Insert DNA 준비
① TA cloning 과정을 통해 확보한 clone을 추가 배양한 후, TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)를 이용하여 정제한다.
② 정제된 Recombinant pMD20-T vector로 아래의 mixture를 조제한다.
Insert가 포함된 pMD20-T vector |
≤ 1 ㎍ |
EcoRI (Code 1040A) |
1~3 Unit |
BamH I (Code 1010A) |
1~3 Unit |
10 x K buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕*2 |
*2 실험 상황에 따라 전체 반응 volume 및 component 사용량을 조절할 것
③ 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 mixture 전량을 전기영동 (loading buffer를 첨가)한다.
④ Insert DNA 단편이 포함된 gel을 최대한 신속하게 잘라낸다.
⑤ TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762)를 이용하여 실온에서 잘라낸 gel의 insert DNA를 정제한다.
⑥ 정제가 완료된 insert DNA를 ligation 반응에 이용한다.
(2) 최종 목적 Vector인 pAAV-CMV vector (Code 6230의 구성품) 준비
① 구축하고자 하는 AAV2 system에서 목적유전자 삽입용 viral vector인 pAAV-CMV vector로 아래의 mixture를 조제한다.
pAAV-CMV vector |
≤ 1 ㎍ |
EcoRI (Code 1040A) |
1~3 Unit |
BamH I (Code 1010A) |
1~3 Unit |
10 x K buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕*2 |
*2 실험 상황에 따라 전체 반응 volume 및 component 사용량 조절할 것
② 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 mixture 전량을 정제한다.
③ 제한효소 반응이 완료된 mixture는 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (Code 9761A) 또는 phenol/chloroform 추출 및 ethanol 침전법으로 정제한다.
④ 정제가 완료된 linear pAAV-CMV vector를 ligation 반응에 이용한다.
2) 식물형질전환을 위한 binary vector을 이용 한 sub-cloning
Agrobacterium rhizogenes (Rhizobium rhizogenes)을 매개로 한 식물 형질전환 실험에 널리 이용되는 binary vector로의 sub-cloning하는 경우, 쌍자엽 식물에는 pRI 201-AN DNA (Code 3264), 단자엽 식물에는 pRI 201-ON DNA (Code 3265)를 이용할 수 있다. pRI 201-AN DNA 이용하는 경우를 예시로 sub-cloning 과정을 소개한다.
(그림. pRI 201-AN Vector map)
(1) Insert DNA 준비
① TA cloning 과정을 통해 확보한 clone을 추가 배양한 후, TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)를 이용하여 정제한다.
② 정제된 Recombinant pMD20-T vector로 아래의 mixture를 조제한다.
Insert가 포함된 pMD20-T vector |
≤ 1 ㎍ |
Nde I (Code 1161A) |
1~3 Unit |
Sac I (Code 1078A) |
1~3 Unit |
10 x T buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕*2 |
*2 실험 상황에 따라 전체 반응 volume 및 component 사용량 조절할 것
③ 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 mixture 전량을 전기영동 (loading buffer를 첨가)한다.
④ Insert DNA 단편이 포함된 gel을 최대한 신속하게 잘라낸다.
⑤ TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762)를 이용하여 실온에서 잘라낸 gel의 insert DNA를 정제한다.
⑥ 정제가 완료된 insert DNA를 ligation 반응에 이용한다.
(2) 최종 목적 Vector인 pRI 201-AN Vector (Code 3264) 준비
① 아래의 mixture를 조제한다.
pRI 201-AN Vector |
≤ 1 ㎍ |
Nde I (Code 1040A) |
1~3 Unit |
Sac I (Code 1010A) |
1~3 Unit |
10 x K buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕*2 |
*2 실험 상황에 따라 전체 반응 volume 및 component 사용량 조절할 것
② 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 mixture 전량을 정제한다.
③ 제한효소 반응이 완료된 mixture는 phenol/chloroform 추출 및 ethanol 침전 또는 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (Code 9761A)를 이용하여 정제한다.
④ 정제가 완료된 linear pRI 201-AN Vector 를 ligation 반응에 이용한다.
2. Ligation
「1) Adeno-associated virus system (AAV2)을 위한 AAV vector의 sub-cloning」 또는
「2) 식물형질전환을 위한 binary vector로의 sub-cloning」
에서 준비한 linear vector와 제한효소 처리된 insert DNA의 ligation을 위해 전통적인 T4 DNA Ligase (Code 2011A) 또는 고효율 ligation premix인 DNA Ligation Mix <Mighty Mix> (Code 6023)을 사용할 수 있다.
- DNA Ligation Kit <Mighty Mix>를 사용하는 경우
① 제한효소 처리 및 정제가 완료된 insert DNA와 linear vector를 이용하여 아래의 ligation mixture를 조제한다.
Linear vector |
25~250 fmol |
정제한 insert DNA |
50 ng（25 fmol） |
Ligation Mix |
5~10 ㎕ (Vector+ insert volume과 동량)을 첨가 |
3. E. coli 형질전환 (transformation)
16℃에서 30 분간 반응한 Ligation mixture를 E. coli에 형질전환 하기 위해 아래의 strain을 이용할 수 있다.
- Heat shock 용:E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128)
E. coli DH5α Competent Cells (Code 9057)
- Electroporation용: E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Code 9028),
E. coli DH5α Electro-Cells (Code 9027)
Electroporation을 실시하는 경우 phenol/chloroform 추출 및 ethanol 침전으로 buffer를 교환한 후 형질전환을 실시한다.
1) E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128) (이하 C.cells)을 이용한 형질전환
① 얼음위에서 C. cells을 녹인 후, 약하게 섞어 14 ml round-bottom tube (Falcon tube 등)로 옮긴다.
② 100 ㎕의 competent cell에 「2) 3'말단에 dA 부가 & TA cloning」 의 ligation 반응액 전량을 넣어준다.
③ 얼음위에서 30분간 방치한다.
④ 42℃, 45초간*1 heat shock 후, 얼음 위에서 1~2분간 방치한다.
⑤ 최종 volume 1 ㎖가 되도록 제품내에 포함된 SOC medium (미리 37℃로 데워둔) 을 넣어준다.
⑥ 37℃에서 160 - 225 rpm으로 1시간 배양한다.
⑦ 적정량을 ampicillin, IPTG*2, X-Gal*2 가 포함되어 있는 LB plate 배지에 도말한 후 37℃에서 overnight 배양한다.
*1 1.5 ㎖ microcentrifuge tube를 이용하는 경우 42℃, 60초간 heat shock 한다.
*2 IPTG (Code 9030) 및 X-Gal (Code 9031) working solution 제작 및 plate 도말 방법
- IPTG: 0.238 g의 IPTG를 10 ㎖ sterile purified water에 녹여 (final conc. 100 mM), 필터링한 후 1 ㎖씩 분주하여 -20℃에 차광하여 보관한다.
Plate (φ 9 cm 기준) 당 25 ㎕씩 도말하여 사용한다.
- X-Gal: dimethylformamide에 20 ㎎/㎖의 농도로 녹인 후 -20℃에 차광하여 보관한다. Plate (φ 9 cm 기준) 당 50 ㎕씩 도말하여 사용한다.
4. Insert 확인
Expression vector의 selection marker의 내성에 따라 형성된 colony 중 insert를 포함한 clone은 white colony를 형성하고, 그렇지 않은 경우 blue colony를 형성한다. 따라서, Blue/white screening을 통해 white colony만을 선별한 후, 다양한 방법으로 insert 삽입여부를 확인할 수 있다.
1) EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Code RR310A)를 이용하여 colony PCR로 insert를 확인
형질전환 후 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 생성된 white colony를 picking하여 PCR 주형으로 direct PCR을 진행할 수 있다. 이때에 Insert PCR시 사용했던 primer를 동일하게 이용하여 T-vector 내의 insert 삽입여부를 확인한다.
① 아래의 PCR mixture를 조제한다.
EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (2X Premix) |
25 ㎕ |
Forward Primer*1 |
0.2 mM (final conc.) |
Reverse Primer*1 |
0.2 mM (final conc.) |
Sterile distilled water |
Up to 50 ㎕*2 |
*2 농도에 비례하게 전체 volume 조절 가능
② ①의 mixture를 PCR tube에 50 ㎕씩 분주한다.
③ 하루동안 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에서 배양한 형질전환된 E. coli 중 white colony의 일부만 tip을 이용해 하나씩 picking 하여 mixture가 분주된 PCR tube에 넣고 조심스럽게 pippetting하여 colony 일부가 풀어 지도록 한다.
④ 아래의 반응조건으로 PCR 증폭한다.
98℃ |
10 sec |
30 cycles |
60℃*3 |
30 sec |
|
72℃ |
1 min/kb |
⑤ PCR 반응이 끝나면 반응액을 전기영동하여 insert가 삽입된 clone을 확인한다.
⑥ Insert가 확인된 clone은 plate에 남아있는 colony의 일부를 다시 tip을 이용하여 약 1~4 ㎖의 LB 액체배지 (ampicillin 포함)에 접종한다.
⑦ 37℃ shaker에서 12~16시간 배양한 후 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)로 plasmid를 정제하여, insert sequence 확인을 위한 sequencing을 진행한다.
2) Recombinant plasmid DNA를 정제, 제한효소로 절단하여 확인
① 형질전환 후 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 생성된 white colony를 tip으로 picking하여 1~4 ㎖의 LB 액체배지 (ampicillin 포함)에 접종한 후, 37 ℃ shaker에서 12~16시간 배양한다.
② TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)를 이용하여 배양한 E.coli 로부터 plasmid를 정제한다.
③ pMD20-T vector의 MCS 에 포함된 제한효소 중 insert DNA를 절단하지 않는 제한효소 2종 (또는 insert에 임의로 부여한 제한효소)을 선택해서 double digestion 한다.
- 제한효소 처리 예시
Plasmid DNA |
100~200 ng |
Hind III (Code 1060A) |
1~3 Unit |
Kpn I (Code 1068A) |
1~3 Unit |
10 x M buffer*1 |
2 ㎕ |
Sterile distilled water |
Up to 20 ㎕ |
④ 37℃, 1~3시간 반응시킨 후 전기영동 (loading buffer를 첨가)하여, insert 및 pMD20-T vector를 확인한다.
⑤ Insert가 확인된 clone은 sequencing을 진행하여 insert 염기서열을 확인한다.
1) Colony PCR 또는 2) 제한효소 처리 등의 방법으로 insert가 확인된 clone을 대량 배양하여, plasmid를 정제한 후 후속실험에 사용한다.