제품설명

본 효소는 인접한 2중 가닥 DNA의 5'-P말단과 3'-OH말단을 phosphodiester 결합으로 연결하는 효소로 보조인자로서 NAD를 필요로 한다. 본 효소는 돌출말단(cohesive end)끼리의 연결반응만 가능하나, PEG와 고농도의 1가 양이온의 존재 하에서는 평활말단(blunt end)을 연결하는 반응도 가능하다. DNA의 5’-P 말단과 RNA의 3’-OH 말단, 그리고 RNA끼리의 연결은 불가능하다.

보존

-20 ℃

농도

60 U/㎕

형상

10 mM	Potassium Phosphate (pH7.5)
50 mM	KCl
1 mM	DTT
1 mM	EDTA
50%	Glycerol

주의

본 제품에는 reaction buffer가 포함되어 있지 않다.

활성의 정의

6 ㎍/20 ㎕의 λDNA-HindIII 분해물을 16℃, 30분 동안에 90%이상 ligation 시키는 효소 활성을 1 U로 한다.

활성 측정용 반응액 조성

30 mM	Tris-HCl (pH8.0)
4 mM	MgCl₂
10 mM	(NH₄)₂SO₄
1.2 mM	EDTA
100 μM	NAD
0.005%	BSA
6 ㎍/20 ㎕	λDNA-Hind III 분해물

순도

-360 U의 본 효소와 1 ㎍의 λDNA-HindIII 분해물을 37℃, 16시간 반응해도 DNA의 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.
-360 U의 본 효소와 1 ㎍의 closed circular (RF I) pBR322 DNA을 37℃, 16시간 반응해도 DNA의 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.
-360 U의 본 효소와 1 ㎍의 16S및 23S rRNA를 37℃, 1시간 반응해도 RNA의 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.

사용상의 주의

본 효소는 과발현 대장균주로부터 정제하여 불순물을 거의 포함하지 않는 고순도의 제품이다. 따라서 고농도이지만 과량을 사용해도 문제가 없다.

용도

Okayama-Berg법과 Gubler-Hoffman법으로 cDNA를 합성할 때 second strand cDNA 합성 (Okayama-Berg법에서의 사용량은 약 50 U, Gubler-Hoffman법에서의 사용량은 약 1.5 U)

기원

Escherichia coli UT 481 carrying the plasmid encoding the ligase

일반적 성질

-분자량, 약 77,000
-소단위, single polypeptide
-최적 pH
pH7.5~8.0(Tris-HCl완충 용액)
pH8.0(인산 완충액)
-보조인자, NAD
-활성화제
2가 양이온: Mg²⁺(1~3 mM), Mn 2⁺ (2~10 mM) 고농도에서는 저해
1가 양이온: NH⁴⁺, K+, Rb⁺, Cs⁺, Li⁺

T4 DNA Ligase와 E. coli DNA Ligase 특성 비교

	T4 DNA Ligase	E. coli DNA Ligase
분자량	약 62,000	약 77,000
최적 pH	7.2~7.8	7.5~8.0
조효소 (coenzyme)	ATP	NAD
환원제	필요	불필요
평활말단의 연결	가능	불가능 (+PEG로 가능)
돌출말단의 연결	가능	가능