- Diversify 방법
본 제품을 사용하면 mutagenesis 유발 조건을 쉽게 조절할 수 있어서 매우 다양한 사이즈의 DNA 서열에도 최적의 mutation를 도입할 수 있다.
Mn2+와 dGTP의 양을 변화시키는 것으로 mutation rate을 1,000 bp당 2~8개까지 선택하는 것이 가능하다.
Diversify 방법에서는 Clontech의 Titanium Taq PCR 효소 시스템을 이용하여 4 kb까지 DNA 단편을 안정적으로 증폭한다. 이와 같이 다양한 사이즈의 DNA 서열을 증폭할 수 있기 때문에 짧은 DNA 단편은 물론, operon, plasmid 그리고 크기가 큰 단백질을 코딩하는 서열에 mutation을 도입하기에도 이상적이다.
Diversify™ PCR Random Mutagenesis Kit는 TITANIUM® Taq DNA Polymerase (Code 639208)와 함께 사용하도록 최적화되어 있으며, TaqStart™ Antibody (Code 639250)를 포함하는 Titanium Taq PCR 효소 시스템과 mutation을 유발하는 buffer와 시약이 모두 포함되어 있다.
그림 1. Buffer 조성에 따른 mutation rate 조절. 다른 dNTPs의 농도는 고정한 채 Mn2+와 dGTP의 농도를 변화시킴으로써 mutagenesis 정도를 조절할 수 있다. Buffer 1, 5, 9번에서 mutation rate는 DNA sequencing을 통해 직접 측정하였다 (각 >15,000 bp). 다른 mutations rate은 정량적 in vivo fidelity assay의 mutagenesis level과 DNA 염기서열 분석 결과를 연관시켜 결정하였다.
그림 2. Diversify™ PCR Random Mutagenesis Kit에 의한 4 kb 단편의 증폭. 그림 1의 buffer 조건에서 4 kb plasmid (lane 1-9)를 증폭한 결과를 전기영동을 통해 확인하였다. 큰 사이즈의 염기서열이 잘 증폭된 것을 확인하였으며, 이론적으로 더 긴 단편의 DNA 역시 mutagenesis 및 증폭이 가능하다.