본 제품의 대체품은 보다 더 direct PCR에 적합하게 업그레이드된 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(Code R076A/B)입니다.

제품설명

이 제품은 파라핀포매(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)에서 DNA를 간편하게 추출 하여 PCR 증폭을하기 위한 제품이다. Crude sample에 대하여 강력한 증폭을 나타내는 MightyAmp DNA Polymerase 와 FFPE 샘플용으로 최적화된 전용 버퍼 및 파라핀 포매 조직 절편에서 효율적으로 DNA를 추출하기 위한 시약으로 구성되어 있다. 전용 버퍼는 파라핀 포매 조직 절편에서 DNA 추출 용액에 포함된 PCR 저해 물질을 중화하는 성분이 포함되어 있다.
본 제품을 사용 하면 복잡하고 시간이 소요되는 탈 파라핀 과정과 DNA 정제 작업을 수행하지 않고, 간편하고 신속하게 DNA 추출 만으로 파라핀 절편에 포함된 소량의 DNA에서 양호한 PCR 증폭이 가능하며, 많은 수의 검체 분석에도 유용하다.
MightyAmp DNA Polymerase 는 98℃까지 polymerase 활성을 억제 하는 강력한 단일 클론 항체를 이용한 Hot Start PCR 용 효소이다.

*주의: 파라핀포매 조직 절편 유래의 DNA는 고정 및 포매처리, DNA 추출 조작에 따라 상태가 다르기 때문에 긴 가닥의 DNA 증폭을 위한 주형으로는 적당하지 않다.
증폭길이가 약 500 bp 이하의 PCR 증폭에 추천한다.

내용

40 회용^*1
MightyAmp DNA Polymerase (1.25 U/㎕)	40 ㎕
2×MightyAmp Buffer for Card (Mg^{2 +}, dNTP plus )^{* 2}	1 ㎖
Extraction Buffer for MightyAmp FFPE	8 ㎖
20 mg / ml Proteinase K	40 ㎕
^{* 1} 반응용량 50 ㎕의 수	^{* 2}Mg²⁺ 농도는 4 mM (2× ), dNTP 농도는 800 ㎛each (2 × )

보존 -20℃

Extraction Buffer for MightyAmp FFPE 는 개봉 후 상온 저장

조작

파라핀 포매 조직 절편에서 DNA 추출
조작은 실내 온도에서 실시한다. 반응은 thermal cycler를 이용한다.

슬라이드위의 파라핀 절편^*1 을 멸균 스파튤라 (spatula) 등을 이용하여 100 μl의 Extraction Buffer for MightyAmp FFPE가 들어있는 PCR 튜브로 옮긴다.
【주의】 Extraction Buffer for MightyAmp FFPE이 침전물을 형성하고 있는 경우에는 온도를 높여 (~60℃) 서서히 교반하여 침전물을 용해한다.
20 mg / ㎖ Proteinase K 1 ㎕를 첨가한다.
60 ℃에서 15 분간 배양 후, 98 ℃에서 5 분간 처리한다.
실온에서 침전이 떨어질 정도로 가볍게 원심분리하여 상층액 (파라핀 추출 상층액 )을 PCR 주형으로 사용한^{* 2}

^{* 1}

^{* 2}

일반적인 PCR 반응액 조성 (Total 50 ㎕ )

	사용량	최종 농도
2 × MightyAmp Buffer for FFPE	25 ㎕	1 ×
Primer 1	15 pmol	0.3 ㎛
Primer 2	15 pmol	0.3 ㎛
파라핀 추출 상층액^{* 1}	≤ 5 ㎕
MightyAmp DNA Polymerase	1 ㎕	1.25 U/50 ㎕
멸균수	up to 50 ㎕

^{* 1} 파라핀 추출 상층액을 PCR 반응의 주형으로 사용시 PCR반응 액의 1 / 10 이하로 한다.

Primer 디자인에 관하여

가능한 OLIGO Primer Analysis Software ( Molecular Biology Insights 사) 등 primer 디자인 소프트웨어를 이용 하여 최적의 배열을 선택합니다.
Tm 값 (아래 식*기준)이 60 ℃ 이상이 되도록 설계할 것을 권장한다.
　　* Tm 값 ( ℃) = [ (nA + nT ) × 2 + ( nC + nG ) × 4] -5

Primer 디자인에 관하여

신장(extension) 온도를 68℃로 설정한 3 step PCR 표준 조건이다.

[3 step PCR ]

98 ℃	2 min. ^{* 1}
↓
98 ℃	10 sec.	┐
60 ℃	15 sec.	│ 40 cycles
68 ℃^{* 2}	30 sec.^{* 3}	┘

MightyAmp DNA Polymerase의 경우 inosine을 포함하는 primer 사용은 피한다.
^{* 1} 강력한 hot start 항체를 사용하고 있기 때문에 반드시 98 ℃, 2 분 초기 변성을 실시하여 항체를 열 변성 시킨다.
^{* 2} 3 step PCR 의 경우 신장 온도를 68 ℃로 설정 한다.
^{* 3} 500 bp 이하의 증폭 신장 시간

전기영동

MightyAmp DNA Polymerase를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 전기 영동 할 경우 TAE Buffer의 사용을 권장한다. TBE Buffer를 사용하면 이동 패턴이 다소 퍼지는 현상이 발생하여 깨끗한 영동 결과를 얻지 못할 수 있다.

PCR 산물에 대해

MightyAmp for FFPE를 사용하여 증폭한 PCR 산물의 대부분은 3' 말단에 A가 1 염기 추가되어 있다. 따라서 PCR 산물을 그대로 T - Vector ( pMD20 : TaKaRa code 3270, pMD19 (Simple ) TaKaRa Code 3271 )에 클로닝 할 수 있다.

문제해결

현상	문제점	대책
증폭되지 않거나 증폭 효율이 좋지 않다.	primer의 Tm 값	위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인한다
	Annealing	2 ℃ 씩 내려 본다
	시료량	시료의 사용량을 감소 또는 증가시켜 본다.
비 특이적 증폭이 현저하다.	primer의 Tm 값	위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인 한다.
	3 step PCR	2 step PCR 을 시도해 본다
	Cycle 수	35 ~ 40 cycles 설정