① Hot Start PCR
PCR 반응액을 섞은 후 주형 DNA denaturation을 위해 온도를 올리는 과정에서 primer가 비특이적으로 주형 DNA에 결합하여 신장반응이 시작될 수 있다.
이러한 원치 않는 반응은 비특이적인 증폭의 원인이 될 수 있는데, 이를 방지하기 위해 화학물질이나 항체를 사용하여 고온에서 PCR 반응을 활성화 시키는 데, 이를 hot start PCR이라고 한다.
다카라 바이오의 Hot Start Version 효소에는 비특이적 증폭을 강력하게 억제하는 항체가 첨가되어 있어 PCR 재현성이 높고, 이 항체는 첫번째 denaturation 단계에서 신속하게 실활되므로 장시간의 activation 단계가 필요하지 않다.

※ MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3 (Code R076A/B)는 예외적으로 강력한 hot start 항체를 사용하여, 98 ℃, 2분의 초기 변성이 필요합니다.



■ 일반 효소와 Hot Start Version 효소의 비교
3명의 실험자가 각각 TaKaRa Ex Taq^® 및 TaKaRa Ex Taq^® Hot Start Version을 사용하여 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다. 각 시약은 얼음 위에 두고, 실온에서 반응액을 만들었다.



② 2 step PCR (shuttle PCR)
PCR의 특이성을 높이는 방법으로 annealing 온도를 높일 수 있는데, annealing 온도를 높여 annealing extension을 한번에 동일한 온도로 수행하는 것을 2 step PCR (shuttle PCR) 이라고 한다. 주로 길이가 긴 증폭산물의 반응에 효과적이고 반응 시간도 단축할 수 있지만, 길이가 긴 primer를 제작할 필요가 있다. 이러한 방법은 특히 증폭산물을 얻을 수 없는 경우나 다수의 단편을 증폭하는 경우에 유효하다.

③ Touch down PCR
Touch down PCR도 마찬가지로 특이성을 높이기 위한 방법으로, 초기 cycle에서 annealing 온도를 높게 설정하고, cycle 마다 annealing 온도를 낮춰가는 방법이다. 증폭하는 주형이 적은 초기 사이클에서 annealing 온도를 높여 가능한 한 비특이적인 증폭을 억제하고, 이 후 annealing 온도를 낮추면서 증폭량을 증가시키는 방법이다. 이러한 방법은 특히 증폭산물을 얻을 수 없는 경우나 다수의 단편을 증폭하는 경우에 유효할 수 있다.
④ Multiplex PCR
Multiplex PCR은 복수의 primer 세트를 동시에 반응액에 넣어, 복수의 타겟 유전자를 증폭하는 방법이다. 이 경우 복수의 primer끼리 상호작용을 계산하여 서로 dimer를 형성하지 않는 조합을 만들어야 하며 복수의 PCR 산물 크기를 agarose gel에서 충분히 구별할 수 있도록 디자인해야 한다.



⑤ Nested PCR
Primer의 위치를 움직일 수 없는 등의 이유로 특정 primer를 사용해야 하지만 일반 PCR로 증폭되지 않거나 여러 단편이 증폭되는 경우에는 nested PCR이 유효하다. 목적 primer 바깥쪽에 다른 primer를 설정하고 먼저 바깥쪽 primer로 증폭한 후 증폭된 주형을 타겟 primer로 증폭한다. 이로써 특이성이 크게 향상되고 증폭량의 개선을 기대할 수 있다. 특히 특정 프라이머로 증폭된 DNA 조각이 필요한 경우에 효과적인 방법이다.