제품설명
Tet-On®은 doxycycline의 유/무에 따라 유전자 발현 (transcription)이 조절되는 inducible system이다. 이중 Tet-On® 3G tetracycline-inducible gene expression system은 3세대의 Tet-On® system으로 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이는 1세대와 2세대인 Tet-On® 과 Tet-On® Advanced system 대비 background 발현을 낮추고 tetracycline 유사체인 doxycycline에 대한 민감도를 향상시킨 기술이다.
표 1
3세대 Tet-on 유도 발현 시스템은 CMV promoter를 사용해 Tet-On® 3G transactivator를 발현하는 기본 시스템 Tet-On® 3G Inducible Expression System을 포함한 다양한 형태로 판매되고 있다.
내용
- 각 제품의 사용자 매뉴얼을 참고하세요.

주의) 이 제품에 포함된 pTRE vector는 plasmid 제작 시 일반적인 plasmid보다 수율이 낮다. 따라서 수율을 높이기 위해 평소보다 배양액 양을 늘려서 사용하는 것을 추천한다.
또한, 시중의 plasmid purification kit를 사용하는 경우 low copy plasmid용 프로토콜을 사용하는 것을 권장한다.
특징
- Bakcground 감소: promoter 서열을 최적화하여 기존의 PTIGHT 대비 background 발현을 5~20배로 감소시켰다. (그림 1.)
- Dox에 대한 민감도 증가: Tet-On® 3G regulator vector의 서열을 최적화하여 doxycycline에 대한 민감도가 대폭 증가되어 보다 낮은 농도의 Dox (5~10 ng/㎖)에서도 발현을 유도할 수 있다. 단 10 ng/㎖를 하룻밤 처리하는 것으로 매우 높은 발현을 유도할 수 있는 고감도의 시스템이다.
- 강한 발현 유도 비율: Tet-On® 3G는 기존의 Tet-On 및 Tet-Off system과 같이 높은 최대 발현 수준을 유지하면서도 background를 크게 줄였기 때문에 발현 유도 시 매우 높은 발현 유도율을 보인다 (그림 2). MCF7 세포를 이용한 실험에서는 최대 27,000배의 유도 비율이 확인되었다.

Tet System Approved FBS
Tet-On® 3G system은 Tet System Approved FBS (Code 631107 외)와 함께 사용하는 것이 중요하다. Tet-On® 3G system doxycycline에 대한 감도가 매우 향상되었기 때문에 tetracycline이 포함되지 않은 FBS를 사용해야 한다. Tet System Approved FBS (Code 631107 외)는 Tet-On® 3G system의 background발현에 영향을 미치지 않는 점이 검증되었기 때문에 해당 제품을 사용하는 것을 추천한다. 각 Tet-On® 3G system에는 Tet System Approved FBS (Code 631107 외) 50 ㎖이 포함되어 있다.

그림 1. PTRE3G 프로모터의 낮은 background발현
Tet-On® 3G system과 Tet-On® Advanced system을 사용하여 HEK293 세포에 각각 regulatory vector와 response vector (luciferase)를 transfection 하였다. 이후 세포를 Dox +/- (0, 50, 500 ng/㎖) 상태로 24시간 배양 후 luciferase의 발현을 측정하였다. 그 결과, Dox가 없는 상태에서는 Tet-On® 3G system에서는 background 발현이 매우 낮았고 (확대된 부분), Dox가 처리된 조건에서는 둘다 매우 강한 발현을 보이는 것을 확인할 수 있다.

그림2. 발현 유도율 (induction rate)이 향상된 Tet-On® 3G 시스템
Tet-On®, Tet-On® Advanced, Tet-On® 3G 세가지 시스템을 사용해 HEK 293 cell과 HeLa cell에 regulatory vector와 response vector (luciferase)를 transfection 후 1 ㎍/㎖ doxycycline으로 luciferase 유전자를 발현시켰다. 이후 18시간 이후 3반복으로 luciferase 활성을 측정한 결과 Tet-On® 3G system이 가장 높은 발현 유도율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

그림3. 민감도가 향상된 Tet-On® 3G 시스템
Genome의 같은 위치에서Tet-On® 3G 와 Tet-On® Advanced의 두 가지 프로모터에 의해 안정적으로 luciferase 유전자를 발현하는 HLF33 cell-line에서 Dox 농도를 바꿔가며 luciferase의 발현량을 측정하였다. 그 결과 5~10 ng/㎖에서는 Tet-On® 3G의 cell-line에서 100~150배 높았고, 50 ng/㎖에서는 발현량이 4.6배 높아졌다.
(University of Erlangen, W. Hillen et. al)

그림4. 10 ng/㎖의 Dox에서도 고감도로 작동하는 Tet-On® 3G

그림5. 매우 높은 S/N ratio의 Tet-On® 3G를 사용한 세포주
세 종류의 Tet-On® 3G cell-line에 response vector (luciferase)를 transfection 했다. 이후 Dox +/- 상태에서 24시간 배양 후 luciferase 활성을 측정한 결과, 모두 수천배의 S/N ratio를 보였다.
용도
- Mammalian cell에서 유전자 발현 유도
- 독성 유전자 발현 제어
- in vivo에서의 목적 유전자 발현 유도
관련제품
- Any vector, any insert, any site로 DNA assembly, In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)
- In-Fusion®에서 최고의 cloning 효율을 위한 전용 E.coli comp.cell, Stellar™ Competent Cells (Code 636763)
- 다양한 cell에 DNA / RNA / 단백질 모두 적용 가능한 transfection 시약, TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Code MIR 6000)
- 내 cell에 맞는 Mirus의 최적 transfection 시약 찾기 online tool, Reagent Agent®
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