· TransIT®-LT1:DNA 비율을 최적화 한다
1 ㎍ DNA 당 시약 2-8 ㎕ 으로 최적 TransIT®-LT1:DNA 비율을 정한다. Transfection 효율이 최고가 되고 cell 독성이 최저가 되는 양을 선택하되, DNA 1㎍ 당TransIT®-LT1 시약 3 ㎕으로 시작한다.

· 무혈청 배지에 있는 cell에 complex를 첨가한 경우
무혈청 배지에서 complex를 형성하고 complete growth media(혈청함유)에 있는 cell에 첨가한다. Complex를 complete growth media에 있는 cell에 첨가하여 4시간 동안 배지 교환이 없으면 transfection의 효율이 개선되고 독성이 감소한다.

· Transfection 시 cell density(% confluence)가 최적이 아닌 경우
Transfection을 하는 시점에서, 대부분의 cell에 대한 권장 cell density는 50-70% confluence이다. 그러나 transfection의 효율 성을 극대화하기 위해서는 각 cell 유형에 따라 최적인 cell density를 정할 필요가 있는 경우도 있다. 향후 실험에서 재현성을 정 확하게 하려면 밀도를 일정하게 유지해야 한다.

· Complex 형성 동안에 배양 시간이 충분하지 않은 경우
권장 complex 형성 시간은 15-30분이다. 이 범위 내의 여러 시간대를 실험하여 각 cell에 따라 최적의 complex 형성 시간을 정 할 필요가 있다.

· Transfection하는 DNA의 purity이 떨어지는 경우 (DNA 준비 중에 부분적으로 분해되거나 endotoxin이 들어갈 수도 있다)
Transfection에 사용되는 DNA는 고도로 정제된 것으로, endotoxin과 같은 오염물질이 없어야 한다. Mirus Bio의 MiraCLEAN® Endotoxin Removal Kit(TaKaRa Code MIR 5900)을 사용하여 endotoxin(bacterial lipopolysaccharide, LPS)을 제거한다. Transfection을 위한 최적 DNA 농도는 6-well plate의 한 well 당 1-5 ㎍ 으로, 6-well plate의 한 well 당 2.5 ㎍의TransIT-LT1 시약을 사용한다.

· TransIT®-LT1 시약/DNA complex 형성 동안에 Fetal calf serum이 존재하는 경우
Complex를 형성할 때에는 무혈청 배지를 사용하고, transfection은 혈청이 있는 상태에서 한다.

· Transfection 동안에 반응 억제제가 존재하는 경우
Dextran sulfate이나 heparin과 같은 polyanion이 존재하면 transfection이 억제된다. 이와 같은 Polyanion이 없는 transfection 배지를 사용을 권장한다.

· Cell 형태가 변화되는 경우
만약 cell passage number가 매우 높거나 너무 낮다면 transfection의 효율에 나쁜 영향을 미친다. 재현성을 높이려면 실험간 비슷한 passage number를 유지한다.