Two-step RT-qPCR을 위한 cDNA 합성 제품
Introduction
Real Time PCR (Quantitative PCR; qPCR)은 유전자발현의 정교한 분석을 위해 일반적으로 널리 사용되는 분자생물학적 기법이다. RNA 샘플을 이용하여 정량 PCR (quantitative PCR 또는 Real Time PCR)을 진행하는 경우,
RNA를 역전사반응 (reverse transcription; RT) 과정을 거쳐 cDNA로 만든 후 Real Time PCR을 진행하게 된다.
Two-step Real Time RT-PCR (또는 RT-qPCR)은 하나의 튜브에서 역전사반응을 마친 후, 튜브를 옮겨 qPCR반응을 진행한다.
그림1. Two-step RT-qPCR 모식도
Two-step RT-qPCR의 장점
- Compatible with limited sample input due to high sensitivity
- Able to optimize RT and qPCR steps separately
- Can generate cDNA stocks
Two-step Real Time RT-PCR 은 RT와 qPCR이 각각의 tube에서 진행되므로, 실험별 조건을 검토하여 반응효율 극대화하거나 반응특이성 향상시키는 등 실험에 맞는 최적의 반응조건을 설정할 수 있다.
적은 수의 샘플로 많은 타겟을 분석하기에 적합하며, cDNA 합성 후 일부만 qPCR에 사용하므로, 실험에 사용했던 cDNA를 보관할 수 있는 이점도 있다.
다만, 2개의 튜브에서 RT와 qPCR을 각각 진행하므로, 시간이 다소 소요되고, 여러 번의 피펫팅으로 인해 실험 에러, 오염 등이 발생할 가능성이 있으며, One-step Real Time RT-PCR에 비해 high-throughput 실험 또는 자동화 장비 적용에 한계가 있을 수 있다.
다카라에서는 Two-step Real Time RT-PCR을 위한 다양한 cDNA 합성제품 (RT)을 판매하고 있으며, 다카라의 다양한 Probe-based qPCR premix, Dye-based (TB Green
®) qPCR premix와 조합하여 사용할 수 있다.
Two-step RT-qPCR using PrimeScript™ RT
Takara의 Two-step RT-qPCR을 위한 cDNA 합성 제품은 Real Time PCR에 최적화되어 있다. 각 키트에는 강력한 Strand displacement 활성을 가지고 있어 효율적으로 cDNA를 합성할 수 있는
PrimeScript™ Reverse Transcriptase가 포함되어 있다. PrimeScript™ Reverse Transcriptase는 다양한 실험에 적용할 수 있고, 특히 full-length cDNA 합성이 필요한 실험에 최적되된 역전사효소이다.
2차구조의 RNA나 GC 서열이 많은 주형 등 다양한 형태의 RNA로부터 역전사반응을 진행할 수 있어, 기본적인 RT 실험과 다소 까다로운 RT 실험에 모두 적용할 수 있는 다재다능한 역전사효소이다.
PrimeScript™ RTase는 RNase H (-)의 변형된 recombinant MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) 효소로 낮은 온도에서도 (예, 42℃) full-length cDNA를 효율적으로 합성하므로, 높은 온도에서 RT 반응을
진행하는 것에 비해 RNA degradation의 위험을 낮출 수 있다.
다카라에서는 아래와 같이 3종의 two-step RT-qPCR을 위한 전용 cDNA 합성 제품을 제공하고 있다.
편리성 - primer, 역전사효소 등이 모두 포함된 premix 타입
PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code RR036A)
Maximum Specificity - gDNA 제거시약 포함
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Code RR047A)
기본 구성 - 각각의 Component로 구성
PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Code RR037A)
Two-step RT-qPCR을 위한 cDNA 합성 제품라인
Citations
RR037A: Makino, K.
et al. Inhibition of uterine sarcoma cell growth through suppression of endogenous tyrosine kinase B signaling.
PLoS One 7, e41049 (2012).
RR036A: Mizutani, R.
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PLoS One 7, e34949 (2012).
RR047A: Sato, Y., Inoue, M., Yoshizawa, T. & Yamagata, K. Moderate hypoxia induces β-cell dysfunction with HIF-1-independent gene expression changes.
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