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qPCR 데이터 해석 방법, 전처리와 일반적인 정량 방법에 대해 이야기 하겠다. 마지막으로 MIQE 가이드라인에 대해 이야기하겠다.

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Baseline 조정

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qPCR 로 샘플을 비교하기 위해서는 동일 level에서 시작해야 한다. 따라서 동일한 zero baseline level에서 시작할 수 있도록 각 증폭곡선을 조정한다. 조정 후에 시작부분은 flat baseline이 되어야 한다. 일반적으로 이 조정은 기기 소프트웨어에 의해 자동으로 수행된다.

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소프트웨어에 따라 여러 가지 baseline 조정 방법이 있다. 일반적으로 소프트웨어마다 1개 이상의 방법이 있고 기본(default) 방법이 좋은 baseline을 얻기 어려울 땐 다른 방법이 사용된다. 많은 소프트웨어는 증폭곡선으로부터 평균을 내고 차감해서 미리 정한 cycle 수를 이용하는 방법이 있다. 다른 옵션은 signal이 baseline을 넘어 증가하는 시점의 대응 cycle 수를 확인하는 방법으로 예를 들면 signal 상승 시작점의 2~3 cycle 지점의 cycle 수를 이용한다. 이 방법은 전체 실험(run)에 적용하거나 각 증폭곡선에 개별적으로 대응할 수도 있다. 첫 번째 cycle은 증폭곡선에 비정상적 현상(artifact)이 나타나기도 하는데 자동적으로 제외시킬 수 없으면 수동으로 제외 시킬 수 있다.

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대부분의 소프트웨어는 slope 조정 기능이 있다. 특히 probe 법을 이용할 때 qPCR baseline에서 관찰되는 slope을 조정한 것이다. 증폭곡선에 비정상적 현상(artifact)가 영향을 미치지 않도록 baseline과 slope 조정은 중요하다.

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증폭곡선에서 Cq 값 결정

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Threshold level을 정해 놓으면 threshold level에 도달한 증폭곡선으로부터 Cq 값이 결정된다. 또는 증폭곡선의 2차 미분 최대값을 Cq값으로 사용한다.

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대부분의 소프트웨어는 다양한 알고리즘을 이용해 threshold level를 자동으로 설정한다. 예를들면, baseline의 noise를 이용하고 고정된 표준 편차의 수에서 threshold level을 설정하거나, 표준곡선에 가장 적합한 데이터를 사용한다. Threshold level을 자동으로 불러올 경우, 로그기(logarithmic phase)이내이면서 baseline의 noise의 artifact 이상으로 threshold level을 설정했는지 확인해야 한다. 수동적으로 threshold level을 설정할 때 같은 기준을 적용한다. 만약 증폭곡선의 logarithmic scale을 사용하면 threshold 설정할 곳을 더 쉽게 확인할 수 있다.

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threshold level이 로그기(logarithmic phase)내에 위치하는지 확인해야 한다. 이 범위 내에 있다면 Cq값이 변한다 해도 샘플간의 Cq값의 차이는 동일하다. 그리고 동일한 qPCR-run으로 증폭된 샘플은 서로 비교할 수 있다.

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Cq 값을 이용하여 다른 샘플간에 타겟의 양을 정량하는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째가 절대 정량이다.

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Real-time quantitative PCR에서 절대정량은 무엇을 의미하는가? 농도를 알고 있는 표준시료(standard)를 serial dilution하여 작성한 standard curve로 모르는 샘플의 농도를 결정하는 방법이다. 모르는 샘플을 표준시료에 비교해야 하기 때문에 측정된 농도가 표준시료보다 정확하지 못할 수 있다. 그럼 standard 준비할 때 필요한 요건은 무엇인가?

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첫째, standard curve는 다양한 범위의 미지 시료를 측정할 수 있어야 한다. 또한 standard curve를 벗어난 범위를 추정해서는 안 된다. qPCR에서는 낮은 농도에서는 확률적 변수와 primer dimer가 있고, 고농도의 DNA에 의해서는 PCR이 저해되기 때문에 실제 테스트 했던 범위내의 standard curve의 값만을 알 수 있다. 둘째, 미지의 시료의 농도를 최대한 정확하게 얻기 위해서는 standard point를 고르게 잡아야 한다.

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Standard는 분석하려는 target과 최대한 유사해야 한다. DNA면 DNA standard로, RNA에는 RNA로, linear에는 linear standard, single stranded에는 single stranded standard 사용해야 한다. Biological target에는 같은 길이의 standard를 사용해야 하며, 만약 protein에 쌓인 형태면, 비슷한 구성의 standard를 이용해야 한다. 또한, 미지의 샘플인 경우 예상되는 유사한 조건의 standard를 사용해야 한다. 그러나 현장 샘플 분석시 종종 하나 이상의 포인트를 절충해야 한다.

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qPCR에서 가장 일반적으로 사용하는 standard는 무엇일까? 일반적으로 정제된 PCR product가 사용된다. 증폭과 정량이 쉽지만 현장 샘플의 타겟 길이와 샘플 matrix를 잘 대변하지는 못한다. 다른 옵션은 PCR product가 cloning된 plasmid를 이용하는 것이다. 이것은 좀더 많은 노력이 필요하지만 타겟이 바이러스나 plasmid 또는 비슷한 길이의 product라면 좀더 길이가 비슷할 수 있다. 만약 gDNA가 타겟이라면, gDNA를 standard로 사용 할 수 있다. 이 경우 standard와 target 사이의 길이와 구성의 유사성이 주요 장점이다. 반면, 정제와 안정성이 문제가 될 수 있다. 만약 one-step RT-PC와 같이 RNA가 타겟이면, RNA standard를 사용하거나, 다른 방법으로 RT양을 결정해야 한다. 이것은 T7 promotor 와 PCR product를 포함한 plasmid와 T7 promotor primer 서열을 갖고 있는 PCR product의 in vitro transcription에 의해 일어난다. RNA standard 사용시 주요 문제는 이 과정이 더욱 수고스럽고 standard의 정량과 안정성이 문제가 될 수 있다는 것이다. 어떤 standard를 사용하던지 철저하게 정제하고, 정량 해야 하며 미지 시료의 범위를 커버할 수 있도록 희석 범위를 결정해야 한다.

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다른 정량 방법으로는 샘플간 양의 비율을 비교하는 상대정량이 있다. 이 방법은 유전자 발현 분석에 사용된다.

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상대정량에서는 다른 샘플 사이에 목적 유전자의 발현을 비교한다. 다른 샘플간에 비교를 위해서 샘플간의 발현차를 normalize하기 위해 reference를 이용한다.

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왜 normalization이 필요한가? 몇 가지 이유가 있는데 예를 들면, 샘플들 간에 적용한 초기 시료량이 다를 수도 있고, 추출 양이 다르거나, RT 효율이 다를 수 있으며 DNA나 RNA의 분해 정도가 다를 수도 있기 때문이다.

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normalization 어떻게 하는가? 몇 가지 옵션이 있다. 일반적으로 동일한 양으로 시작하려고 하나 쉽지 않다. 특히 샘플의 양이 적은 경우 쉽지 않다. 어떤 경우에는, 세포 수를 계산하여 각 샘플에 동일한 수의 세포를 사용할 수 있다. 충분한 total RNA가 있다면 RT시 각 샘플에 동량의 total RNA를 첨가하는 것이 일반적이다. 이 방법은 RT수율이나 qPCR의 억제에 의한 차이가 고려되지 않았다. 이를 RNA spike를 이용해 qPCR 실험을 분석하거나 reference gene의 발현 분석을 통해 어느 정도 설명할 수 있다. 이 경우 많은 유전자를 분석하는 경우, 모든 유전자의 평균 발현이 샘플들 간 발현을 normalize하는데 사용되기도 한다. Normalization이 종종 다른 수준으로 진행될지라도, 유전자 발현 분석에서 가장 흔한 것은 하나 이상의 reference gene을 사용하는 것이다.

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Reference gene 이란 무엇인가? Reference gene은 수행하고 있는 실험에서 항상 발현되는 유전자이다. 그러나 universal reference gene 같은 것은 없다. 모든 유전자는 특정 조건 하에서 조절되며, 조절되는 유전자를 사용하면 데이터를 왜곡시켜 잘못된 결론을 내릴 수 있다. 따라서 진행하는 실험에서 reference gene으로 이용하는 유전자가 조절되지 않았는지 확인하는 것이 매우 중요하다. 또한 사용했던 reference gene을 입증하고 분석의 질을 높이기 위해 하나 이상의 reference gene을 이용하는 것이 좋다.

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좋은 reference gene 선택을 위해 대표 샘플들을 이용해서 몇 개의 후보 reference gene을 반응 시켜보는 게 일반적이다. 이때 예상되는 모든 데이터 그룹의 샘플을 포함시키는 것이 중요하다. 그 후 생성된 데이터는 좋은 reference gene을 선별할 수 있는 알고리즘으로 분석한다. 일반적으로 알고리즘 GeNorm과 Normfinder를 사용한다. 대부분 알고리즘으로 reference genes를 선택하기 때문에 후보 reference genes을 선택할 때 co-regulation 되지 않는 유전자를 선택해야 한다. 그렇지 않으면, co-regulated genes이 sample set에서 조절될 수도 있지만 reference gene 쌍으로 추천 될 수도 있다.

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Reference gene 선별 결과 최고의 reference gene을 찾을 수 있고 정확도 높은 reference gene의수를 확인 할 수 있을 것이다.

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Reference gene을 이용해 두 샘플내의 타겟 유전자의 상대적 발현을 계산 할 수 있다. 이것은 얼마나 많은 정보를 갖고 있으며 다른 샘플로 이뤄진 다른 실험의 qPCR효율을 추정할 수 있는지에 따라 달라진다.

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모든 샘플이 모든 assay에서 같은 효율을 갖고 있다고 추정된다면, ddcq 방정식을 사용할 수 있다. 모든 유전자가 모든 샘플에서 100% 효율을 갖는다고 가정하자. 적어도 모든 샘플이 각 assay에서 같은 효율을 보인다면, 다른 assay는 다른 효율을 보인다고 고려할 필요가 있다. 그리고 만약 효율을 가정할 수 없다면, full equation을 이용해야 하며 실제 모든 샘플에서 각 유전자의 효율을 결정해야 한다.

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MIQE guideline에 대해 말하겠다.

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MIQE guideline의 목적은 RT-qPCR 실험을 적절하게 수행하기 위해 필요한 실험 단계마다 항목을 제공하기 위한 것이다. 또한 발표하는 데이터의 질을 보장하기 위해 검토자와 편집자들에게 가이드라인을 제공하기 위한 것이다.

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왜 필요한가? Real-time qPCR은 단시간에 인기있는 분석 도구가 되었으나 qPCR 실험을 수행하는 최선의 방법에 대해서는 합의가 부족하다. 그러한 이유로 MIQE guidelines은 과학적 문헌의 완전성을 보증하고 실험실간의 일관성을 증진시키고 실험 투명성을 증진 시키기 위한 체크리스트이다.

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• qPCR 실험시 첫 번째 직면하는 문제는 샘플링이다. 자연환경에서 샘플이 이동될 때, 어떤 유전자들은 활성화되지만 다른 유전자는 억제된다. 실험관(test tube)에서 측정된 발현 프로파일은 자연상태의 세포 발현을 반영하지 못할 수도 있다.
• 추후 실험을 위해 샘플 보존한다면 보존 방식에 따라 편향된 RNA를 갖게 될 수도 있다.
• 오래된 샘플은 분해된 RNA를 가지고 있을 수 있다.
• 특정한 RNA 종류는 다른 양으로 추출되기 때문에 비교를 어렵게 한다.
• RT양은 primer 종류, 효소, 반응 조건에 따라 달라진다. 그 차이가 200배에 이를 수 있다.
• Template의 고차구조와 실험 성능에 따라 RNA 증폭 양이 다를 수 있다.
• 상대적 정량에서 expression normalization하여 측정하는 것이 중요하며 다양한 디자인 방법과 과 normalization 방법이 있다.

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전에 간과되었을 수도 있는 점을 극복하기 위해 해야 할 것은 무엇인가? 먼저, 모든 실험 단계가 상세히 기재되어 있는지 확인해야 한다. 그리고, nucleic acid target을 철저히 분석하고 qPCR 실험을 확실히 검증해야 한다. 어떻게 데이터 분석이 이루어지고 reference gene이 선택되었는지에 관한 정보가 필요하다.

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실험 디자인부터 데이터분석까지 9 단계로 단순화하였다. 각 단계마다 확인해야 하는 항목은 다르며, 문서로 제출해야만 하는 필수 항목과 가능하다면 제출해야 하는 선택항목으로 구성되어 있다.

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이런 항목을 체크리스트로 요약했다. 필수정보는 E로 표시하고, 선택정보는 D로 표기되어 있어 모든 정보가 제공되었는지 확인할 수 있다.

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MIQE 가이드라인에 대해 더 알고 싶다면 이 자료나 그 이후 버전을 확인하면 된다.