• 대사 장애 세포 모델을 위한 기능이 향상된 간세포 - 특이적 마커 발현 및 기능 확인
• 포도당 조절 기능 확인
• 지질 대사 기능 확인
• NAFLD 세포 모델 - 지방증 유도에 따른 중성지방(triglyceride), TNFα. 증가 확인

Introduction
비알코올성 지방간질환 (non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD), 대사증후군, 제2형 당뇨병, 비만과 같은 대사 질환은 크게 증가하고 있다. 지질 대사나 혈당 조절 등 신체 내 500가지 이상의 주요 기능을 수행하고 있는 간의 기능 저하는 NAFLD, 제2형 당뇨병, 대사증후군, 비만과 모두 밀접하게 관련되어 있다 (그림 1). 예를 들어, NAFLD는 제2형 당뇨병 발병의 위험 요소로써, 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, 이하 NASH)로 진행될 수 있다. 비만과 관련되어 있는 대사증후군은 제2형 당뇨병과 심혈관 질환으로 진행될 수 있는 위험이 있다. 게다가, 가족성 고콜레스테롤혈증 (familial hypercholesterolemia), 알파-1 항트립신 결핍증 (Alpha-1 Antitrypsin Deficiency), 당원병 (glycogen storage diseases)과 같은 유전성 대사 장애 질환은 대사효소 결핍과 간기능 저하를 유발하는 유전자 결함을 포함한다.



그림 1. 대사질환과 간기능 저하 간의 상관관계
간기능 저하는 관련된 대사 질환으로 이어질 수 있다. 혈압, 혈당, 혈청 중성지방, LDL 수치가 증가하거나 비정상적인 비만 등을 포함하는 대사증후군은 역시 간기능 저하로 유발될 수 있으며, 제2형 당뇨병으로 진행될 수 있다. 간기능 저하는 NAFLD 또한 유발할 수 있으며, 이는 알코올에 의한 것이 아닌 대사 기능 장애로 인해 간에서 지방이 축적되어 지방증이 될 때 발생한다. NAFLD는 NASH을 거쳐 간 경변으로 진행될 수 있고, NAFLD 환자는 종종 인슐린 저항성을 유발할 수 있으며, 당뇨병 환자는 NASH로 진행될 수 있다. 이는 간이 여러 대사 질환 간의 상호작용을 매개하고 있음을 보여준다 (Tilg, Moschen, and Roden 2016).

간 대사 질환의 분자적 메커니즘은 아직까지 잘 알려지지 않았으며, in vitro 질병 모델은 이 매커니즘 연구에 매우 중요하게 되었다. In vitro 실험 모델은 간 인슐린 저항성, 지질 대사, 유리 지방산 축적에서 보이는 대사 특성을 나타낼 수 있어야 하나, 가장 일반적으로 사용되고 있는 세포 모델은 human primary hepatocyte (이하 hphep)로, 획득할 수 있는 간세포의 수가 제한적이고, 기증자 간의 특성 차이가 크기 때문에 사용에 한계가 있다.
이러한 제약이 없는 인간유도만능줄기세포 (human induced pluripotent stem cell, 이하 hiPSC)로부터 분화된 간세포는 각각의 hiPSC가 무한 증식할 수 있어 간세포 수급이 원활하고, 건강한 사람 혹은 질병이 있는 사람으로부터 비침습적으로 간세포를 얻을 수 있어, 세포 모델로 고려할 수 있다. 이 모델은 특히 유전자 편집을 통해 특정 질병에 관련된 돌연변이를 포함하는 세포를 제작하여 활용할 수 있으며, 대사 질환의 원인과 진행 과정을 연구하는 데에 사용할 수 있다. 그러나, hiPSC 유래 간세포는 유전자 편집을 통한 간기능 확인 등 in vitro 상에서만 활용할 수 있다는 것이 한계로 보인다.
최근까지 hiPSC 유래 간세포는 대사 질환 모델링으로 사용되기에 기능이 충분하지 않았다. 이를 해결하기 위해, 다카라바이오는 다양한 hiPSC 세포주에서 높은 분화 효율을 보이는 간세포 분화 프로토콜을 최적화하였고 (Ghosheh et al. 2016), 간세포로 분화된 후에 장기간 배양이 가능한 배지를 개발하였다. 이 분화 프로토콜을 이용하여 3종의 hiPSC 세포주 (ChiPSC12, ChiPSC18, ChiPSC22, 이하 C12, C18, C22)를 enhanced hiPS-HEP로 분화한 제품을 제공하고 있다. 분화된 간세포 3종은 lot 별 variation을 최소화하였기에, 실험 전반에 걸쳐 신뢰도 높은 기능 연구를 진행할 수 있다. Cellartis^® enhanced hiPS-HEP 세포는 성인 간세포 특성을 나타내며, 2주간 약물 대사 기능을 유지할 수 있다. 아래의 실험 결과에서 대사 질환에서의 간세포 기능 평가에 hiPS-HEP가 적합함을 확인할 수 있다.

Results
[ Enhanced hiPS-HEP cells express hepatocyte markers and display functional characteristics of mature hepatocytes ]
HNF4α (Hepatocyte nuclear factor 4α)는 간 발달 및 간 특이 유전자의 발현을 조절하는데 필요한 전사 인자로, 주요한 대사 경로와 관련되어 있다 (Gonzalez 2008). 다카라바이오의 프로토콜을 이용해 분화된 간세포를 면역형광염색했을 때, 90% 이상의 세포에서 HNF4α를 발현함을 확인하였다 (Asplund et al. 2016). ASGPR1 (Asialoglycoprotein receptor 1)는 간에서 특이적으로 발현되는 세포 표면 단백질 중 하나로, 성숙한 간에서 나타나는 마커로 알려져 있다 (Takayama et al. 2014; Peters et al. 2016). 그림 2에서 enhanced hiPS-HEP가 핵에서 HNF4α를, 세포 막에서 ASGPR1를 균일하게 발현하고 있음을 확인하였다. 특히, 해동 12일 후의 enhanced hiPS-HEP에서 발현하는 HNF4α와 ASGPR1의 발현 수준은 해동 1일 후의 hphep에서 보이는 것과 비슷하며, 이는 장기 배양에도 간세포 특이적인 마커의 발현을 높은 수준으로 유지함을 의미한다.



그림 2. Enhanced hiPS-HEP 세포에서 성숙한 간세포 마커의 발현 확인
(Panel A, B) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP 세포 (해동 12일 후)와 hphep 세포 (해동 1일 후)에서의 HNF4α와 ASGPR1 발현을 면역형광염색을 통해 비교하였다 (Scale bar = 50 ㎛).
(Panel C) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP 세포 (해동 12일 후)와 hphep 세포 (해동 1일 후)에서의 HNF4α와 ASGPR1 mRNA 발현을 정량 분석하였다.

생체 내 성숙한 간세포의 많은 기능 중, 알부민 (albumin)과 요소 (urea)의 합성 및 분비 능력은 in vitro 모델을 평가하는데 주로 사용되고 있다. 알부민은 혈액 내 삼투압을 조절하고, 혈청 내 알부민 수치가 낮은 경우 간 경변 혹은 만성 간염을 의심해 볼 수 있다. 요소는 간에서 단백질이 분해되는 과정에서 발생되는 물질로써, 요소 합성 장애는 간 기능 저하를 의심해볼 수 있다. 간에서 생성되는 α1AT (alpha-1-antitrypsin)는 간세포 모델을 평가하는데 사용되는 또 다른 특이적 물질로써, 결핍 시에는 만성 조직 파괴 및 간 손상을 유발한다.
3종의 hiPSC로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP에서 알부민과 a1AT이 잘 발현되고 있음을 면역형광염색과 mRNA 발현 분석을 통해 확인하였다. 특히, Enhanced hiPS-HEP와 hphep 배양에서 알부민의 강한 발현을 확인하였으며, 간 조직 슬라이스에서 확인되는 대사의 대상 구조 (Jungermann and Kietzmann 2000) 와 일치한다 (그림 3, Panel A).
게다가, Enhanced hiPS-HEP는 요소 회로와 관련된 유전자를 hphep와 유사한 수준으로 발현하고 (그림 3, Panel B), 알부민과 요소를 분비한다 (그림 3, Panel C). 해동 후 4일, 6일, 12일, 20일 째의 Enhanced hiPS-HEP에서 알부민 분비는 hphep 세포의 해동 1일 후와 유사하거나 더 높은 수준으로 확인 되었다. 해동 후 13일, 20일 째의 enhanced hiPS-HEP는 hphep (해동 후 1일)에 비해 낮은 요소 분비능을 보였으나, 배양 기간에 따라 점차 높은 기능을 확인하였다.




그림 3. 성숙한 간세포와 Enhanced hiPS-HEP 세포 간의 기능 특성 비교
(Panel A, B) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 12일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 알부민과 α1AT 발현을 면역형광염색을 통해 비교하였다. 알부민의 경우, 실제 간 조직 슬라이스에서 면역형광염색을 함께 확인하였다 (Scale bar = 50 ㎛).
(Panel C) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 13일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 요소 회로와 관련된 효소의 발현을 확인하였다.
(Panel D) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 13일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 ALB와 a1AT mRNA 발현을 정량 분석하였다.
* CPS1 = carbamoyl-phosphate synthase; OTC = ornithine carbamoyltransferase; ASS1 = argininosuccinate synthase; ASL = argininosuccinate lyase; and ARG1 = arginase-1.
(Panel E, F) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 후 4일, 6일, 12일, 20일 후)와 hphep (해동 1일 후)를 1일간 배양한 배지를 이용해 ELISA로 알부민과 요소 분비능을 확인하였다.

[ Enhanced hiPS-HEP cells show functional glucose regulation ]
간세포는 포도당 생산을 조절함으로써 에너지 대사를 수행한다. 간은 인슐린 작용에 의해 혈당 수치가 높을 때에는 포도당을 Glycogen 형태로 저장하고 포도당 생성을 줄이는 반면, 혈당 수치가 낮을 때에는 저장되어 있는 glycogen을 분해하고, 포도당을 생성한다. NAFLD, 제2형 당뇨병, 대사 증후군이 있는 경우에는 간세포의 인슐린 저항성으로 인해 혈당이 치솟게 된다.
대사 질환 연구를 위한 간세포 모델은 인슐린에 의한 포도당 조절 기능을 정상적으로 가지고 있어야 한다. Enhanced hiPS-HEP는 낮은 농도의 인슐린으로도 protein kinase B-α (Akt)의 인산화 반응을 보였을 뿐 아니라 (그림 4, Panel E, F), 글리코겐 생성과 당 신생 과정, 인슐린 기전과 연관된 유전자들을 hphep 수준으로 발현함을 확인하였고 (그림 4, Panel B, C, D), glycogen 저장 능력 또한 확인되었다 (그림 4, Panel A).




그림 4. Enhanced hiPS-HEP의 정상적인 인슐린 반응과 포도당 조절 기능 확인
(Panel A) hiPSC C18 세포주로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 12일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 glycogen 저장 능력을 확인하였다. (Scale bar = 100 ㎛)
(Panel B-D) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 12일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 glycogen 대사 (Panel B), 당 신생 (Panel C), 인슐린 기전 (Panel D)에 관련된 유전자들의 mRNA 발현을 정량 분석하였다.
* AGL = glycogen debranching enzyme; GSK3A/B = glycogen synthase kinase 3 α/β; GYS2 = glycogen synthase 2; PYGL = glycogen phosphorylase, liver form; PCK1/2 = phosphoenolpyruvate carboxykinase 1/2; FBP1/2 = fructose-1,6-bisphosphatase 1/2; G6PC = glucose-6-phosphatase; G6PD = glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase; GLUT-2 = glucose transporter 2; INSR = insulin receptor; IRS1/2 = insulin receptor substrate 1/2; PIK3CA/B/D = PI3-kinase subunit α/β/δ; and AKT1 = protein kinase B-α. 
(Panel E) hiPSC C18 세포주로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 12일 후)에서 인슐린으로 인한 Akt 단백질 인산화 반응 수준을 western blot으로 확인하였다.
(Panel F) hiPSC C18 세포주로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 6일 후)에서 Akt pS473의 인산화 반응을 ELISA로 확인하였다. 0nM, 2nM 농도의 인슐린에서 Akt 인산화 반응을 확인하였으나, 측정되지 않았다.

[ Enhanced hiPS-HEP cells show functional lipid metabolism ]
건강한 사람의 경우, 음식 섭취 후 지방산과 스테롤, 지질단백질을 간 안팎으로 운반하지만, 다양한 질병 상태에 따라 대사 과정의 기능 장애가 발생하게 되고, 이러한 물질이 축적되기 시작한다. 일반적으로 간은 LDL (Low-density lipoprotein)을 흡수하고 VLDL (Very-low-density lipoprotein)과 HDL (High-density lipoprotein)을 분비함으로써 혈액 내 지질단백질에 의한 조직 운반 콜레스테롤 수치를 조절하게 된다. PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)는 LDL receptor와의 상호작용을 통해 혈장 콜레스테롤의 항상성을 조절하는 효소다. 콜레스테롤을 운반하는 LDL 입자가 LDL receptor에 결합하게 되면 이는 간세포로 이동하고, 이 receptor를 타겟으로 하여 PCSK9는 lysosome 분해를 진행한다. PCSK9가 저해되면, LDL 수용체가 세포막으로 다시 이동하고, 세포 외 용액에서 LDL 입자를 제거할 수 있게 된다. PCSK9가 혈중 LDL 농도를 낮춤으로써 콜레스테롤의 수치 또한 낮출 수 있기에, 이를 이용한 약물 2종이 2015년에 미국 FDA에서 승인되었다.
Enhanced hiPS-HEP는 지방산의 흡수, 합성 및 beta oxidation에 관여하는 주요 유전자를 hphep과 유사한 수준으로 발현하고 있음을 확인하였다 (그림 5, Panel C). 또한 enhanced hiPS-HEP는 LDL receptor를 높은 수준으로 발현하고 (그림 5, Panel B), 형광 표지된 LDL을 uptake한다 (그림 5, Panel A). 뿐만 아니라, Enhanced hiPS-HEP에서 혈중 콜레스테롤 수치를 조절하는데 관여하는 다른 유전자 (e.g., apolipoprotein B (VLDL), apolipoprotein A1 (HDL), PCSK9, sterol regulatory element-binding proteins 1 and 2 (SREBP-1 and -2), lipoprotein lipase (LPL))의 발현이 확인되었다. 이는 지질단백질 내의 중성지방을 유리지방산과 Glycerol로 가수분해하는 유전자로써, enhanced hiPS-HEP가 지질 대사에 중요한 여러 유전자를 발현하고 있음을 의미한다.




그림 5. Enhanced hiPS-HEP에서 보이는 지질 대사의 주요 특징
(Panel A) 2종의 hiPSC (C12, C18)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 6일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서의 알부민과 α1AT 발현을 면역형광염색을 통해 비교하였다. 알부민의 경우, 인간 간 조직 슬라이스에서 면역형광염색을 함께 확인하였다 (Scale bar = 50 ㎛). 해동 후 4일, 12일 후의 세포에서 또한 유사한 LDL uptake를 확인하였다 (Data not shown).
(Panel B, C) 3종의 hiPSC (C12, C18, C22)로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 13일 후)와 hphep (해동 1일 후)에서 혈중 콜레스테롤 조절과 지방산 대사 과정에 관여하는 유전자들의 mRNA 발현을 정량 분석하였다.
* LDLR = LDL receptor; APOB/A1 = apolipoprotein B-100/A1; PCSK9 = proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; SREBP-1/2 = sterol regulatory element-binding protein 1/2; LPL = lipoprotein lipase; FATP2/4/5 = fatty acid transporter protein 2/4/5; FASN = fatty acid synthase; SCD5 = stearoyl-CoA desaturase 5; ACADL = acyl-CoA dehydrogenase; L-FABP = liver fatty acid-binding protein; and CPT1A = carnitine O-palmitoyltransferase 1. [ Modeling nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) ]
NAFLD는 간세포의 지방 흡수와 배출 과정에 불균형이 발생함으로써 비정상적으로 중성 지방을 축적하거나 지방증을 유발한다. NAFLD의 말기에 이르면 지방 축적으로 인해 만성적으로 ER stress를 생성함으로써 염증을 유발하게 되며, 이를 NASH로 분류한다 (Zhang et al. 2014, Zhang and Kaufman, 2008). ER stress를 활성화하는 thapsigargin과 같은 물질은 ER stress가 염증이나 섬유종 마커인 TNFα의 상승을 유발하는지 확인하는 지표로써 사용될 수 있다.
Enhanced hiPS-HEP에 thapsigargin과 저농도, 고농도의 불포화 지방산 (oleic acid, 이하 OA)을 24시간 처리했을 때, 지질 내 중성지방을 축적하고 (그림 6, Panel A), TNFα mRNA 발현이 증가함을 확인하였다 (그림 6, Panel B).



그림 6. 중성지방의 축적과 지방증에서 나타나는 TNFα 염증 마커의 발현 증가
hiPSC C18 세포주로부터 분화된 enhanced hiPS-HEP (해동 6일 후)를 BSA vehicle control, 200 μM의 OA, 200 μM OA와 1 μM의 thapsigargin, 600 μM OA를 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
(Panel A) 고정된 세포는 Oil Red O를 이용하여 염색되었으며, 세포 내 지질은 붉은 색으로 확인된다 (Scale bar = 50 ㎛). 해동 후 4일, 12일 후의 세포에서 또한 유사한 Oil Red O 염색 결과를 확인하였다 (Data not shown).
(Panel B) TNFα mRNA 발현을 qPCR로 측정했을 때, thapsigargin와 관계없이 OA를 처리한 세포에서 control보다 높은 발현을 보였다.

Conclusions
다카라바이오의 고효율 분화 프로토콜에 따라 분화되고, 배양된 hiPSC 유래 간세포는 NAFLD/NASH, 제2형 당뇨병, 대사증후군을 포함한 간 대사 장애와 관련 질병에 대한 이해를 높이고자 사용되기에 충분한 기능을 가지고 있으며, lot variation을 최소화하여 일관된 세포 공급이 가능하다. Cellartis^® enhanced hiPS-HEP는 hphep와 같은 성숙한 간세포에서 나타나는 HNF4α, ASGPR1, α1AT와 같은 유전자의 발현, 알부민과 요소 분비, 포도당과 지질 조절 기능의 특성을 나타낼 뿐 아니라, NAFLD의 진행 과정을 모방한 지방증 유도 조건에서 염증 반응이 확인되었다. 또한 배양 5일차부터 최대 19일까지 완전한 기능을 확인할 수 있으며, 약 14일 이상의 assay window를 가진다. Enhanced hiPS-HEP 세포는 총 3종의 hiPSC로부터 분화된 각각의 제품 라인을 보유하고 있고, 간세포 분화 서비스를 통해 원하는 세포주를 이용할 수도 있다.

Code	제품명	용량
Y10133	Cellartis® Enhanced hiPS-HEP v2 (from ChiPSC12) kit	1 Kit
Y10134	Cellartis® Enhanced hiPS-HEP v2 (from ChiPSC18) kit	1 Kit
Y10135	Cellartis® Enhanced hiPS-HEP v2 (from ChiPSC12) kit	1 Kit

*본 Cellartis® Enhanced hiPS-HEP v2 제품은 custom product로 운영되는 제품으로, 제품 관련 자세한 내용은 다카라코리아 고객지원 (TEL. 02-2081-2510, support@takara.co.kr)으로 문의 바랍니다.

[원문] Next-generation human iPS cell-derived hepatocytes for metabolic disease modeling
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