Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP v2 kit (Code Y10133외)은 장기 분석을 위한 완전한 배지와 구성품을 포함하는 사용자 친화적인 형태로 공급하고 있습니다. 다른 간 세포 모델과 비교하여, 이 제품내에 포함된 인간 유도 만능 줄기(hiPS) 세포 유래 간세포는 더 오래 배양이 가능하므로, 대사 질환 모델링 및 만성 독성 실험을 위한 보다 더 긴 분석 기간을 가질 수 있습니다.


Q1. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포의 출처(source)는 무엇인가요?
Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 인간 유도 만능 줄기(hiPS) 세포주 ChiPSC12, ChiPSC18 및 ChiPSC22에서 분화되었습니다. 이 cell line들은 Oct4, Sox2, Klf4 와 c-Myc (pRV-OCT4-SOX2-KLF4-MYC; vector map은 비공개)을 가지고 있는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 결함이 있는 폴리시스트론 레트로바이러스 기술(defective polycistronic retrovirus technology)로 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 리프로그래밍하여 제작하였습니다. 역전사효소 활성 테스트로 hiPS 세포주에 복제 가능 레트로바이러스가 포함되어 있지 않음을 확인하였고, 또한, 바이러스 리프로그래밍 유전자도 발현되지 않음을 확인하였습니다.

Q2. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 유전적으로 변형(조작)되었나요?
아니요. 일부 간세포에서는 간 기능을 개선하기 위해 유전 공학 기술을 사용합니다만, 당사는 전반적으로 기능을 향상시키는 배양 프로토콜을 개발하여 적용하였습니다. Cellartis^® 간세포의 소스(source)인 각 hiPS 세포주는 통합적인 레트로바이러스 기술을 사용하여 리프로그래밍하였습니다. 복제 능력이 있는 레트로바이러스가 없음을 확인하기 위해 hiPS 세포주에서 역전사효소 활성을 테스트하였으며, 리프로그래밍에 사용된 인자가 hiPS 세포주에서 발현되지 않는 것도 확인하였습니다.

Q3. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 여러 hiPS 세포주에서 분화한 세포를 제공가능한가요?
예, Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 ChiPSC12, ChiPSC18 및 ChiPSC22의 세 가지 세포주에서 분화하여 제공하고 있습니다. 다양한 hiPS 세포주로부터 분화한 간세포는 개인 간의 유전적 변이를 모델링하므로, 본 세포에서는 다양한 표현형 변이를 관찰할 수 있습니다.

Q4. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포를 해동한 후 언제 테스트에 사용할 수 있나요?
내부 테스트 결과, 해동 후 4~19일째에 높고 일정한 CYP 효소 활성과 알부민 및 요소 분비가 검출되었습니다. CYP 활성(상단 패널)은 해동 후 4, 12, 19일에 LC/MS로 측정하였습니다. 알부민과 요소 분비(하단 패널)는 해동 후 4, 6, 12 및 20일과 13 ,20일에 각각 ELISA로 측정하였습니다. 두 실험 모두 20시간(상단) 또는 24시간 (하단) 후에 인간 일차 간세포(human primary hepatocyte, hphep)와 비교하였습니다.


Q5. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP v2 kit과 이전 버전의 차이점은 무엇인가요?
Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP v2 kit은 일차세포 및 종양 기반 세포 모델에 대한 대안으로, 더 오래 지속되고 간 세포의 기능을 가지고 있어, hiPS 세포 유래 성숙한 간세포에 대한 요구에 부합하는 제품입니다. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP v2 kit에는 이전 버전과 동일한 고성능 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포가 포함되어 있습니다. 두 가지 버전 모두 해동 배지(thawing medium), 코팅제재(coating), 배양 배지(plating medium) 및 세척 배지(washing medium)를 포함하고 있습니다. 이외에 V2 kit에는 Enhanced hiPS-HEP 세포의 확장된 배양을 위한 장기 유지 배지(long-term maintenance medium)가 포함되어 있어 질병 모델링 및 약물 개발(discovery) 실험에 최적입니다.

Q6. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 수송체 단백질을 발현하나요?
예. 테스트에서 ChiPSC12, ChiPSC18, ChiPSC22에서 분화된 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 아래와 같이 여러 운반체를 발현하였습니다 - NTCP, OCT1, OATP1B1, OATP1B3(흡수, 패널 A), MRP2, MDR1, BSEP(유출, 패널 B). 일부 수송체는 냉동 보존된 인간 일차 간세포(hphep)와 유사한 수준으로 발현되었으며, 다른 일부 수송체는 hphep보다 낮은 수준으로 발현되었습니다. OATP1B3 mRNA 발현은 ChiPSC18에서 유래된 향상된 hiPS-HEP 세포에서는 관찰되지 않았습니다. 패널 C에 hphep mRNA 발현은 점선으로 표시하였습니다.


Q7. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 phase II 효소를 발현하나요?
예. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에서 UGT1A1, UGT2B7 mRNA 발현을 확인할 수 있었으며(패널 A), 냉동 보존된 인간 일차 간세포와 유사하거나 더 높은 수준으로 발현함을 확인하였습니다(패널 B). Enhanced hiPS-HEP 세포는 LC/MS로 측정한 결과, 24시간 동안 배양한 냉동보존 인간 일차 간세포와 유사하거나 더 높은 수준의 phase II 효소(UGT와 sulfotransferase(SULT)) 활성을 나타냈습니다(패널 C).


Q8. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에서 CYP 효소 활성을 유도할 수 있나요?
세포는 quality control 과정 중에 측정된 기본 CYP 효소 활성을 가지고 있으며, 이는 Certificate of Analysis(CoA)에 표기되어 있습니다. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP cells의 2D 배양에서 최소한의 CYP 유도가 관찰됩니다.

Q9. 태아(fetal) CYP3A7이 이들 세포의 전반적인 CYP 활동과 연관이 있나요?
CYP 활성 분석으로는 CYP3A4(adult), CYP3A5(adult) 및 CYP3A7(fetal)을 구분할 수 없지만, qPCR을 이용하면 가능합니다. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포의 CYP3A4와 CYP3A5의 mRNA 발현 수준은 매우 높고, CYP3A7은 매우 낮은 수준이었습니다. 이를 24시간 동안 배양한 냉동 보존된 인간 일차 간세포와 비교하여 표현하였습니다(패널 A). 흥미롭게도, CYP 발현의 개인간 변이는 다양한 hiPS 세포주에서 유래된 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에서도 관찰할 수 있었습니다. 인간 일차 간세포의 CYP 효소의 mRNA 발현은 패널 B에 이 점선으로 표시하였습니다.


Q10. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포의 순도는 >90%입니다. 나머지 10%는 어떤 세포인가요?
이 10%의 세포는 다른 내배엽 세포의 혼합물일 가능성이 높지만, 정확한 구성은 알 수 없습니다. 분화의 첫 단계에서 고순도 내배엽세포부터 시작하여, 최종 분화가 완료된 세포에는 미분화 줄기세포가 없음을 염색을 통해 확인합니다.

Q11. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포가 성숙한(mature) 간세포인지 어떻게 알 수 있나요?
세포의 성숙도를 결정하기 위해 우리는 태아 및 성인 간세포에서 발현되는 것으로 알려진 유전자를 조사하고, 일차 간세포와 어떤 차이가 있는지 여러 분석법으로 테스트했습니다. 당사는 면역형광법, 활성측정법 및 qPCR 분석을 통해 알부민, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, HNFα 및 ASGPR1과 같은 여러 성인 간세포 마커의 높은 발현과 활성을 확인하였습니다. 또한 태아 유전자인 CYP3A7의 발현이 낮은 것을 확인하였으며, 이는 일차 간세포의 수준과 유사하였습니다. 이 데이터는 Technote에서 확인할 수 있습니다.

Q12. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에서 담관 형성(formation of bile canaliculi)을 관찰할 수 있나요?
아니오, 이들 세포에서는 담관 형성을 확인할 수 없었습니다.

Q1. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 어떻게 배송되나요?
Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 극저온에서 냉동시켜 cryovial로 배송하며, Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP v2 kit의 다른 구성품과 같이 제공됩니다. 이 kit에는 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP의 해동 배지(thawing medium), 코팅제재(coating), 배양 배지(plating medium), 세척 배지(washing medium)와 장기 유지 배지(long-term maintenance medium)도 포함되어 있으며, 이 모든 구성품은 드라이아이스에 패킹하여 공급하고 있습니다.

Q2. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에는 어떤 배양 용기가 적합합니까?
96 well plate, 24 well plate를 권장합니다.

Q3. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포 배양에 다른 유지 배지나 코팅을 사용할 수 있습니까?
Kit에 제공되는 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 해동 배지(thawing medium), 코팅제재(coating), 배양 배지(plating medium), 세척 배지(washing medium)와 장기 유지 배지(long-term maintenance medium)를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 구성품은 모두 kit에 포함되어 있으며, 포함된 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포를 사용하여 최적의 성능과 결과를 얻는 데 중요합니다. 다른 코팅제재나 media를 사용할 수 있지만 최적의 성능을 보장할 수는 없습니다.

Q4. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 장기 유지 배지 (long-term maintenance medium)에 dexamethasone, hydrocortisone, DMSO가 포함되어 있나요?
예, Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 장기 유지 배지에는 위의 세 가지 구성 성분이 모두 포함되어 있습니다. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포의 성능을 dexamethasone, hydrocortisone, DMSO가 포함되어 있지 않은 배지에서 평가한 자료는 보유하고 있지 않습니다.

Q5. 플레이팅 후 1일차에 세포를 세척(wash)해야 하는 이유는 무엇인가요?
정상적으로 부착되지 않은 세포 제거를 위해서 플레이팅 후 1일차에 세척 배지(wash media)로 세척하는 것이 필요합니다. 세척할 때는, 한 번에 몇 개의 well씩 나눠서 media를 모두 조심스럽게 제거하면서 진행해 주세요. 절대 well이 마르지 않도록 해주세요.

Q6. 3일차부터 부분으로 media를 교체하는 이유는 무엇인가요?
Media를 모두(100%) 교체시 발생할 수 있는 반복적인 건조현상으로 인해 well의 가장자리의 세포가 박리될 수 있습니다. 배지의 90%만 교체하면, 세포에 media가 남아있어 건조 및 박리를 방지할 수 있습니다. 분석이나 면역세포화학 염색을 위한 세척시에는 세포에 소량의 완충액(buffer)이나 세척용액(washing solution)을 남겨두고, 세척 회수를 늘리는 것이 좋습니다.

Q7. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 주말 동안 배지 교체없이 배양할 수 있나요?
예, 금요일에 media를 50% 더 추가해 주세요(예시: 24 well plate 1.5ml/well, 96 well plate 230 ㎕/well). 이 경우 금요일 늦은 시간, 월요일 이른 아침에 media를 교체하는 것이 가장 좋습니다.

Q8. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 증식이 가능한가요?
아니요, Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포는 최종 분화된 간세포로 증식이 불가능합니다.

Q9. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포에서 CYP 효소 활성은 어떻게 측정했나요?
액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS)을 사용하여 아세트아미노펜(acetaminophen)(CYP1A), 4-OH-디클로페낙(4-OH-Diclofenac) (CYP2C9), OH-부푸랄롤(OH-Bufuralol) (CYP2D6) 및 1-OH-미다졸람(1-OH-Midazolam) (CYP3A)과 같은 특정 대사산물의 형성을 측정했습니다. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포의 CYP 활성은 일상적인 품질 관리의 일환으로 해동 후 4일, 12일, 19일째에 분석하였습니다. LC/MS 분석은 독일 Pharmacelsus GmbH에서 수행하였습니다.

CYP 활성을 측정하기 위해 Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포를 미리 예열한 William medium E (+0.1% PEST)로 2회 세척한 후, 미리 예열한 0.1% PEST, 25mM HEPES, 2mM L-글루타민(L-Glutamine)을 포함한 William medium E를 배양 면적 cm2당 110 ㎕ 넣고 다음의 probe-substrate cocktail을 추가하여 분석하였습니다.

CYP	Substrate	Concentration
1A	Phenacetin	10 μM
2B6	Bupropion	10 μM
2C9	Diclofenac	10 μM
2D6	Bufuralol	10 μM
3A	Midazolam	5 μM

37°C에서 2시간 후, 100 ㎕ 상청액을 수집하여 LC/MS 분석까지 -80°C에서 보관했습니다. LC/MS로 측정된 대사물질 농도는 well당 단백질 양 (Pierce BCA Protein Assay Kit 사용)과 분석 기간 (120분)을 적용하여 normalize하였습니다.

Q10. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포 배양과정에서 droplet이 보이는데, 정상인가요?
이러한 현상(liquid extrusions)은 정상입니다. 저속 촬영 기록(time-lapse recordings)으로 간세포가 이러한 방울(drop)을 media로 방출하고 이후 정상적으로 유지되는 것을 관찰했습니다. 이는 세포 사멸의 징후가 아니며, 이러한 방울이 관찰된 배양에서도 활성 분석은 정상적으로 수행할 수 있었습니다. 확인을 위해 Oil Red O로 배양물을 염색하였으나, 이 방울은 염색되지 않았으며, 이는 이 방울이 지질 방울이 아님을 의미합니다. 방울의 정확한 특성은 알려지지 않았지만, 이 방울이 나타나더라도, 세포 성능은 그대로 유지되는 것을 확인하였습니다.


Q11. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포 배양에서 돔(dome)형 구조가 보이는데, 정상인가요?
때때로 이러한 돔(dome)형 구조가 보이지만, 전체 세포 성능에는 영향을 미치지 않습니다. 이러한 구조에서는 간세포가 코팅에서 분리되는데, 아마도 간세포가 매우 조밀하게 성장했기 때문일 것입니다. 세포 손실을 방지하기 위해서는 media를 변경할 때 주의해주세요. 항상 각 well에 10%의 media를 남겨주세요.


Q12. Cellartis^® Enhanced hiPS-HEP 세포를 3D spheroid로 배양할 수 있나요?
예, ultra-low attachment plates를 사용하여 성공적으로 3D spheroid를 생성했습니다. Spheroid는 배양 시 3~4주간 유지되었습니다.