• 다양한 조건에서 빠르고 쉽게 정제
• 다양한 lysis buffer와의 호환성
• 여러 his-tagged 단백질을 동시에 정제

■ Introduction
재조합 단백질 생산은 학교부터 생물약제학, 농업 산업에 이르기까지 대부분의 연구 분야에서 중요한 기술이다. 태그된 단백질을 생산하고 정제하는 데 적절한 방법을 사용하면 의미 있는 데이터를 효율적으로 얻고 거의 모든 실험에 활용할 수 있게 된다. 기존의 방법은 시간과 노력이 많이 드는 반면, Capturem™ his-tagged 정제 제품은 단백질 정제에서 놀라운 변화를 보여준다. 속도, 사용 용이성, 높은 capacity를 하나의 강력한 시스템으로 통합함으로써 단백질 실험이 이전과는 비교할 수 없을 정도로 크게 발전할 수 있도록 한다.

단백질 정제는 일반적으로 immobilized metal affinity chromatography (IMAC) 레진 컬럼으로 진행한다. 레진 컬럼은 높은 capacity을 갖고 있지만 equilibration 시간과 결합 시간이 길고, 큰 단백질 분자의 경우 레진 층에 느리게 확산되어 실험이 몇 시간씩 걸리기도 한다. 반면 Capturem™ his-tagged 정제 kit는 차세대 멤브레인 기술을 적용하여 이러한 병목현상을 해결하고 5분 실온 프로토콜로 고순도, 고수율 정제가 가능하다. 스핀 컬럼은 이전의 멤브레인과 비교해서 단백질이 더 많이 결합할 수 있도록 새롭게 변형된 나일론 기반 멤브레인이 사용되었다. Capturem™ 기술을 이용하는 다양한 형태의 키트를 판매하며, 각 키트의 샘플적용 양과 정제수율은 아래와 같다.

표1. Capturem™을 이용한 His-tagged protein 정제 제품

	Capturem™ His-Tagged Purification Miniprep Kit	Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit	Capturem™ His-Tagged Purification 96-Well Plate	Capturem™ His-Tagged Purification 24-Well Plate	Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume
Code	635710	635713	635714	635730	635724
형태	Miniprep Column	Maxiprep column	96 Nickel plate	24 Nickel plate	Large volume unit
Input sample	~ 800 ㎕	~ 25 ㎕	~ 1,000 ㎕	~ 4 ㎖	150 ~ 500 ㎖
용량	20 회	6 회	96 well	24 well	4 회
소요시간	5 분	15 분	15 분	15 분	15 ~ 30 분
정제농도	0.3 ~ 1 ㎎/㎖	1.6 ~ 4.5 ㎎/㎖	0.3 ~ 1 ㎎/㎖	~ 0.8 ㎎/1㎖	up to 2.0 ㎎/㎖
정제수율***	80㎍/column	1.5 ㎎/tube	80㎍/well	800㎍/well	10~25 ㎎/unit
Centrifuge 조건	11,000 x g, 1분	2,000 x g, 3분*	2,000 x g, 3분*	600 x g, 2분*	X
Vacuum 여부	X	X	O	O	O**
Buffer 포함 여부	O	O	X	X	X

^* Maxiprep Kit에는 50㎖ tube용, 24well plate, 96well plate에는 각각 24well plate, 96well plate용 centrifuge가 필요합니다.
^** Large volume의 경우, Vacuum source (e.g. vacuum pump equipped with a trap and a vacuum controller, or a peristaltic pump)가 필요하다.
^*** 정제수율은 사용하고자 하시는 Sample type, species, antibody isotype에 따라 달라질 수 있습니다.


그림 1. Capturem™ Ni2+ membrane technology. 각 Capturem™ his-tagged spin column에는 높은 membrane 표면적에 고용량 Ni2+이 포함되어 있어 기존 멤브레인의 pore보다 단백질 결합 용량(capacity)이 크다.

빠른 속도로 진행되는 본 제품의 실험과정으로 인해 단백질을 고순도 및 고수율로 생산하는 것뿐만 아니라 단백질 분해나 활성 손실 가능성을 크게 줄여 후속실험에서의 성공률을 높일 수 있다.

또한 native 또는 denaturing 조건에서도 일관되게 작동하기 때문에 글리세롤, TCEP 등의 additives가 존재하는 경우나 동시에 정제하는 경우에도 편리하게 사용 가능하다.

특징	장점
5~15분 실온 프로토콜	Cold room이 필요 없으며 시간을 절약할 수 있음
bed volume과 wash 버퍼 부피비 (1:300) 가 높음	고순도 용출 가능 (작은 베드 용량으로 인한 적은 오염물질 존재) ; 상대적으로 많은 양의 wash 버퍼 (베드 용량의 300배)를 사용해 세척 효율을 높임
작은 bed volume	고농도의 단백질 정제가 가능 ( ~0.3 에서 4.5 ㎎/㎖).
포유류 세포 및 박테리아 용해물과의 호환성	다양한 실험 시스템에 적용해 쉽게 실험할 수 있음.
짧은 결합 시간	시간을 절약하고 단백질 degradation이나 활성감소의 가능성을 줄여줌, 후속실험에서 더 높은 성공률
일반적인 additive 가 포함되거나 native 또는 denaturing 조건에서도 높은 성능	다양한 실험 조건도 사용할 수 있는 유연성
다양한 lysis buffer 적용 가능	다양한 lysis 시스템의 선택가능

■ Results
다양한 실험조건에서 뛰어난 성능
재조합 단백질 정제는 denaturing 조건과 샘플 또는 버퍼 내 additives 존재 등 기존 시스템에서는 문제가 될 수 있는 여러 요인들을 가지고 있다. Capturem™ His-tagged 정제 키트는 이러한 잠재적인 위험요인에도 불구하고 높은 성능을 유지한다.

6xhis-tagged GFPuv (~29 kDa) 를 정제하면서 여러 additives를 다양한 농도에서 테스트한 결과, 표준 프로토콜을 사용하여 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), beta-mercaptoethanol (βME), tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), dithiothreitol (DTT), and glycerol의 존재 하에 성공적으로 단백질을 정제하였다. 모든 경우에, 결합된 단백질은 대부분 첫번째 용출 단계에서 회수되었으며, 용출된 양은 컬럼 당 75 ㎍에서 >200 ㎍였다.


그림 2. 다양한 농도의 여러 additives 존재 하에서 GFPuv 정제.  각 실험의 sample, equilibration, wash, elution 버퍼에 additives가 포함되어 있다. 각 샘플은 elution 버퍼 300 ㎕을 사용하여 두 번 용출하였다.

동일한 native 와 denaturing 조건에도 his-tagged protein의 정제 효율을 비교하였다. 표준 프로토콜을 적용하였으며, 모든 샘플에서 denaturing 조건과 상관없이 정제가 잘 되었음을 겔 이미지로 확인할 수 있다.


Figure 3. Native 및 denaturing 조건에서의 GFPuv 정제. 스핀 컬럼에 800 ㎕의 세포 용해물을 로딩하였으며, 모든 단계는 native (control) 와 denaturing 조건에 적합한 버퍼를 사용하였다. 샘플에는 8 M urea 또는 6 M HNC(NH2)2 가 포함되어 있다.

타사 lysis buffers와의 호환성
이 향상된 멤브레인 기술은 다양한 lysis 버퍼와 호환 가능하여 사용 편의성을 더해준다. His-tagged 단백질을 포함하는 세포 용해물은 xTractor Buffer™ 와 타사 두 종류의 lysis 버퍼를 이용해 준비했다. His-tagged purification miniprep kit의 표준 프로토콜에서 모든 샘플에 대해 편차가 발생하지 않았다. 이 결과는 lysis 과정 전반에 걸쳐 높은 호환성을 가진다는 것을 보여준다.


Figure 4. 다양한 lysis 버퍼와 스핀 컬럼과의 호환성. 다양한 lysis 버퍼로 준비한 세포 용해물을 모두 표준 프로토콜에 따라 처리하고 두 번 정제하였다.

His-tagged 단백질의 동시 정제
Capturem™ 기술을 his-tagged 단백질의 동시 정제에도 테스트하였다. 하나의 스핀 컬럼에 ~600 ㎕의 단백질 칵테일을 로딩하였고 표준 정제 프로토콜을 적용하여 원하는 단백질을 높은 수율과 품질로 5 분 내로 회수할 수 있음을 확인하였다.


Figure 5. 여러 6x his-tagged 단백질의 정제. 스핀 컬럼에 6xHN-AcGFP (29.6 kDa), 6xHN-FLAG-Myc-DsRed (~31.5 kDa), 6xhis-AB2431 (~17 kDa), 그리고 6xhis-ubiquitin (10.7 kDa) 를 포함하는 단백질 칵테일을 로딩하여 정제하였다.

■ Summary
Capturem™ his-tagged 정제 시스템은 포유류 및 박테리아 세포 용해물로부터 재조합 단백질을 정제하기 위한 혁신적인 솔루션이다. 화학적으로 향상된 표면적을 가진 높은 수용력의 멤브레인은 기존 레진 기반의 기술의 한계를 뛰어넘는 중요한 발전을 이루었다. 이는 높은 정제 효율과 동시에 cold room 없이 간편하고 빠르게 진행할 수 있는 차세대 기술로, 단백질 연구를 위한 수많은 실험들을 간소화할 수 있다. Additives가 있거나 denaturing 조건에서도 높은 수율과 순도가 유지되는데, 다양한 lysis 버퍼를 함께 사용하거나 동시 정제를 할 경우에도 일관된 결과를 얻을 수 있다.

■ Methods
스핀 컬럼은 먼저 equilibration을 위하여 400 ㎕의 xTractor™ 버퍼를 컬럼에 첨가하여 11,000g 에서 1분 동안 원심분리하였다. Equilibration 된 컬럼에 400-750 ㎕의 6xhis-tagged 융합단백질을 발현하는 세포 용해물을 로딩하고 실온에서 1분 동안 11,000g에서 원심분리하였다. 결합된 단백질은 300 ㎕ wash 버퍼로 세척해 500 mM imidazole을 포함한 elution 버퍼 300 ㎕ 를 사용하여 용출하였다. 용출된 fraction은 전기영동을 통해 분석하였으며 4-20% SDS polyacrylamide 겔로 단백질의 순도를 확인하였다. Gel은 Commassie blue를 사용하여 staining하고 표준 프로토콜에 따라 destaining하였다. 6xhis-tagged GFPuv에 해당하는 ~29 kDa 분자량에서 예상 밴드가 관찰되었다.

샘플과 각 버퍼에 포함된 additives 와 다양한 시약들 간의 호환성은 표준 프로토콜에 따라 테스트하였다. 모든 경우에 샘플은 elution 버퍼 300 ㎕에 두 번 용출하였다. EDTA는 1, 5, 10 mM 농도에서, βME는 10, 20, 30 mM에서, TCEP는 1, 5, 10mM에서 테스트하였다. 10mM TCEP를 첨가하면 용해물에서 침전물이 두껍게 관찰되었는데, 이는 용액 내 단백질일 가능성이 크다. (flowthrough lane은 이 실험에서 단백질이 거의 존재하지 않음을 보여준다.) 이 침전물은 컬럼에 로딩하지 않았다. DTT 호환성은 1, 5, 10 mM에서 테스트하였다. 글리세롤은 equilibration과 wash 버퍼에서는 10%, elution 버퍼에서는 5와 10% 농도로 테스트하였다.
Native 및 denaturing 조건에서의 정제는 표준 프로토콜을 따랐지만 세포 용해물 800 ㎕을 사용하였다. 모든 단계에서 native 및 denaturing 조건에 대해 적합한 버퍼를 사용하였으며 샘플에는 8 M urea 또는 6 M HNC(NH₂)₂ 가 포함되어 있다.

Lysis 버퍼 호환성은 xTractor Buffer™ 와 타사 두 종류의 lysis 버퍼로 준비해 테스트하였다. 각 샘플은 표준 프로토콜에 따라 2회 반복으로 정제되었다. 다중 his-tagged 단백질의 tandem 정제는 510 ㎕ 6xHN-AcGFP (29.6 kDa), 19 ㎕ 6xHN-FLAG-Myc-DsRed (~31.5 kDa), 10 ㎕ 6xhis-AB2431 (~17 kDa), 그리고 62.5 ㎕ 6xhis-ubiquitin (10.7 kDa) 를 포함하는 약 600 ㎕의 단백질 칵테일을 표준 프로토콜에 따라 테스트하였다.