■ Introduction
기존의 레진 기반의 immunoprecipitation (IP)과 co-immunoprecipitation (Co-IP) 방법은 특성이 잘 알려져 있고 대중적으로 사용되어 왔지만, 시간과 노동력을 많이 필요로 한다. 특히 이 방법은 transmembrane protein의 발현이 높은 경우에도 문제가 될 수 있었다. 베른 대학교의 연구자들은 고용량 Protein A 멤브레인이 특징인 당사의 Capturem™ IP & Co-IP Kit를 이용하여 앞의 문제들의 탁월한 대안임을 발견하였다. 이 방법을 이용하면 어려운 심장 voltage-gated channel 단백질을 효율적으로 복구할 수 있다.

Capturem™ IP & Co-IP Kit를 사용하면 두 channel 모두를 효율적으로 IP 할 수 있고 Cav1.2-α1c 와 Cav1.2-α2δ1 subunit의 Co-IP도 효율적으로 할 수 있다. 이는 쥐의 심실 심장 조직과 같은 까다로운 샘플의 용해물을 사용하여 in-vivo IP를 수행하기 위한 기술로서 적절함을 보여준다. -Sabrina Guichard, Hugues Abriel, and Jean-Sebastien Rougier of the Institute of Biochemistry and Molecular Medicine at the University of Bern

■ Results
심장 voltage-gated channel 단백질의 효율적인 IP

Voltage-gated ion channel은 심장 근육을 포함하여 몸 전체의 근육세포를 자극하고 조절하는데 중요한 역할을 하는 transmembrane 단백질이다. 유사한 구조의 나트륨 및 칼슘 channel은 심장 수축을 위한 요소이다. 각 channel은 여러 subunit으로 구성되어 있으며 1차 subunit은 pore를 형성하고 보조 subunit는 기능을 조절한다.

Voltage-gated 나트륨 (Nav1.5)과 칼슘 (Cav1.2-α1c) channel의 IP 그리고 보조 칼슘 channel의 subunit(Cav1.2-α2δ1)과의 Co-IP를 Capturem™ IP & Co-IP Kit로 진행하였다. 용해물은 약 40 주령의 성체 쥐의 심실에서 얻어냈고, IP는 각각 Nav1.5 (패널A) 과 Cav1.2 (패널B)에 대한 항체를 넣거나 항체 없이 인큐베이션 후 수행되었다. IP된 fraction은 Nav1.5 (패널A), Cav1.2-α1c (패널B, 점선상단) 또는 Cav1.2-α1c (패널B, 점선 하단)에 대한 항체를 사용하여 western blot으로 시각화하였다. Input 레인은 IP 과정없이 타겟 단백질을 포함한 전체 심장 용해물을 보여준다.
패널 A와 B에서 볼 수 있듯이 Capturem™ IP & Co-IP Kit를 사용하면 두 channel 모두 효율적인 IP가 생성되고 Cav1.2-α1c와 Cav1.2-α2δ1 subunit의 효율적인 Co-IP도 생성된다. 이러한 데이터는 쥐 심실 심장조직과 같은 까다로운 샘플에서 용해물의 IP를 수행할 때 Capturem™ 기술에 강점이 있음을 보여준다.


그림 1. Voltage-gated 나트륨 channel (Nav1.5, 패널A), 칼슘channel (Cav1.2-α1c, 패널B, 점선상단)의 IP와 Cav1.2-α1c (패널B, 점선 하단)과의 Co-IP가 Capturem™ IP & Co-IP Kit을 사용하여 수행되었다.

■ Conclusions
Capturem™ IP & Co-IP Kit는 기존 레진 기반 방법을 개선하여 심장 voltage-gated channel 단백질의 효율적인 IP 및 Co-IP를 제공한다. 우수한 실험 결과는 유지하면서 실험 프로토콜이 단 5분으로 간소화된다. 이런 프로토콜의 빠른 속도는 실험이 오래 걸리는 레진 기반 실험과정에서 발생할 수 있는 분해 또는 활성 손실가능성으로부터 항체-단백질 복합체를 보호할 수 있다.

■ Methods
Nav1.5의 IP

• 약 40 주령의 쥐로부터 심장 2개 (좌심실과 우심실)를 채취하였다.
• 직접 만든 lysis 버퍼를 사용하여 단백질 추출물을 만들었다.
• 3.75 ㎎의 단백질 aliquot을 0.95 ㎎/㎖ (40 ㎕= 38 ㎍)의 anti-Nav1.5 antibody (Alomone labs, cat. #AGP-008) 과 함께 인큐베이션하였다.
• IP는 Capturem™ IP & Co-IP Kit의 사용자 매뉴얼에 따라 수행되었다.

Nav1.5의 western blot

• Nav1.5 밴드는 직접 만든 토끼 anti-Nav1.5를 1:200 배 희석하여 시각화하였다.

Cav1.2-α1c의 IP

• 약 40 주령의 쥐로부터 심장 1개 (좌심실과 우심실)를 채취하였다.
• 직접 만든 lysis 버퍼를 사용하여 단백질 추출물을 만들었다.
• 3.75 ㎎의 단백질 aliquot을 0.80 ㎎/㎖ (20 ㎕= 16 ㎍)의 anti-Cav1.2-α1c antibody (Alomone Labs, cat. #ACC003)과 함께 인큐베이션하였다.
• IP and Co-IP는 Capturem™ IP & Co-IP Kit의 사용자 매뉴얼에 따라 수행되었다.

Cav1.2-α1c의 western blot

• Cav1.2-α1c 밴드는 1:1,000 희석한 쥐 anti-Cav1.2-α1c (UC Davis/NIH NeuroMab clone N263/31) 를 사용하여 시각화하였다.
• Cav1.2-α2δ1 밴드는 1:400 희석한 쥐 anti-Cav1.2-α2δ1 (Abcam, cat. #ab2864)을 사용하여 시각화하였다.

■ 관련 제품
- 총 15분이면 Immunoprecipitation (IP, Co-IP) 실험 완료: Capturem™ IP & Co-IP Kit (Codee 635721)