iPSC 유래 질병 모델 개발을 위한 적절한 도구 선택 방법
How to choose the right tools for iPSC-derived disease model development
DATE: April 16, 2019
전염병에서부터 암, 신경퇴행성 질병 등의 다양한 질병을 위해 수많은 국가 및 세계 보건 연구소들은 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 새로운 치료법을 개발하며 약물 개발에 초점을 맞추고 있다.
이러한 목표를 달성하기 위해 신뢰할 수 있고 중개의학적으로 관련된 질병모델을 생성하는 것이 중요하다. 기존에는 동물 모델이 인간 질병을 시뮬레이션 하는 데 사용되었지만, 종 간 유전적 차이는 아무리 작더라도 종종 연구결과가 해석되지 되지 않는 경우가 있기 때문이다.
이러한 상황에서 최근 몇 년 동안 동물 모델이나 동물 모델이나 확보가 어려운 체세포 모델 대신 접근성이 좋은 인간유도만능 줄기세포 (hiPSC)가 질병모델 연구에 이상적이라는 점이 밝혀졌다.
CRISPR/Cas9를 사용하여 이러한 세포를 유전자 편집하면, 건강한 세포에 질병의 원인으로 추정되는 돌연변이를 도입하여 기본 메커니즘을 이해하고, 치료법 개발을 위해 건강하지 않은 세포의 돌연변이를 수정하거나, 새로운 약물을 위한 대규모 스크리닝을 진행하는 등 다양한 실험을 수행할 수 있다.
그러나 hiPSC에서 성공적으로 유전자를 편집하고 다양한 클론을 확립하는 것은 효율이 낮고, 시간이 오래 걸리기 때문에 이러한 모델을 생성하는 과정에 많은 어려움을 겪을 수 있다. 계속해서 확장되는 다양한 연구 도구를 손쉽게 사용하면 질병 모델을 직접 개발하거나 프로세스를 아웃소싱하여 연구에 집중할 수 있는 다양한 옵션을 활용할 수 있다.
성공적인 질병 모델을 제작하는 데 필요한 모든 다운스트림 애플리케이션에서 각 개발 단계에 대해 어떤 기준을 고려해야 할 지 도움이 될 만한 사항을 아래에서 확인할 수 있다.
Culture systems for initial growth
일반적인 2D 콜로니 배양에서 성장할 때 세포 집단은 균일하지 않다. 군집 중앙의 세포는 밀도가 높은 반면 가장자리의 세포는 더 크고 증식성이 높다. hiPSC에서 상동성 재조합 (homologous recombination)의 전반적인 효율이 낮기 때문에, 이러한 "가장자리 세포"의 형태를 갖는 균질한 세포 집단이 있는 경우 성공적인 유전자 편집 가능성이 훨씬 더 높아진다.
실험 시작 단계부터 성공 가능성을 높이기 위해 균일한 초기 배양 환경을 제공할 수 있는 culture system을 찾는다.
CRISPR/Cas9 for accurate gene editing
유전자 편집을 위한 CRISPR/Cas9 전달은 플라스미드 또는 바이러스 기반 방법을 통해 수행될 수 있다. 그러나 이러한 프로토콜은 세포에서 Cas9의 장기간 발현으로 이어지며, 이는 결국 표적 외 효과 (off-target effect)와 세포 독성 가능성을 증가시킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 ribonucleoprotein (RNP) 형태의 Cas9-sgRNA 복합체 전달을 위한 고효율 전기천공법 (electroporation)으로 세포 내의 Cas9 유지시간을 제한하는 것을 강력히 권장한다. 이를 통해 footprint-free editing 으로 세포주는 게놈에 대해 추가 수정이 되지 않고 원했던 변화만 반영된다.
추가적으로 유전자 편집에서는 sgRNA 설계 및 homology-directed repair (HDR)에 사용하는 donor template의 형태가 중요하다. 좀 더 효과적이고 성공적인 유전자 편집을 위해 Cas9과 결합하여 안정적인 복합체를 형성하도록 최적화된 sgRNA scaffold 디자인을 사용해야 한다. Knockin 실험의 경우, 이중 가닥의 DNA template보다 독성과 무작위적인 integration이 적다고 알려진 단일 가닥의 DNA donor template을 사용할 것을 권장한다.
Screening of edited cell populations
유전자 편집 후에는 필연적으로 이질적인 세포 집단이 생기며, 일부는 wild type, 일부는 타겟 유전자좌 (locus)에 변이가 생긴다. 이 시점에서 성공적으로 편집된 클론을 식별하려면 처리량이 많고 효율적인 스크리닝 방법이 필요하다. 클론 세포주는 서로 다른 속도로 성장하므로 타이밍이 중요하며, 편집된 콜로니를 가능한 한 빨리 식별(identification)하면 배양이 촉진되고 다능성이 유지된다.
이를 염두에 두고, 다음 단계는 정확한 스크리닝을 위해 모집단에서 단일 세포를 분리하고 웰 당 세포 하나씩 플레이팅 하는 것이다.
단일 세포의 분리는 FACS 또는 제한 희석 (limiting dilution)을 통해 수행될 수 있다. 선별 방법은 민감하고 정확해야 하지만 속도와 사용 편의성도 그만큼 중요한 부분이다. 형광 단백질이 포함된 시스템을 선택하면 편집된 클론을 쉽게 식별할 수 있으며, 간소화된 실험과정 및/또는 높은 처리량 기능을 갖춘 프로토콜은 처리과정을 최소화하여 전체 세포 집단을 빠르게 작업할 수 있다.
Culture systems for single-cell cloning and expansion
편집된 hiPSC를 분리하고 스크리닝 한 후에는 이를 확대배양하여 원하는 돌연변이가 있는 클론 세포주를 생성할 차례이다. 개별 세포 배양 시 기존의 2D 배양 방법으로는 종종 세포 사멸 비율이 높아지거나 확대배양 효율이 떨어지는 어려움이 있다. 또한 만약 확대배양 되었더라도, 생성된 클론 세포주는 다능성을 상실하여 다른 세포로 분화하는 능력을 상실할 수도 있다. 따라서 단일 세포의 생존 뿐만 아니라 클론 세포주로의 확대 배양 및 이 과정에서 다능성을 유지하도록 지원하는 배양 시스템을 선택하는 것이 중요하다.
hiPSC를 배양할 때 항상 돌연변이가 발생할 위험이 있으며, 이는 배양 기간이 길어질수록 증가한다. 따라서 핵형에 따라 클론 세포주의 특성을 파악하는 것이 중요하다. 이상적으로는 많은 계대 횟수 후에도 세포가 정상적이고 안정적인 핵형을 유지해야 다운스트림 응용 분야에 적합하다.
약물 스크리닝을 포함하여 임상 및 제약 분야에서 더 크고 더 강력한 실험은 hiPSC 배양을 확장하는 능력이다. 소규모 프로젝트와 마찬가지로 처리량이 많은 애플리케이션에는 다능성과 핵형 안정성을 유지하면서 훨씬 더 큰 규모로 고품질 세포를 생산할 수 있는 균일한 배양이 필요하며, 배양 규모가 증가함에 따라 배양 환경 내에 변동성은 더 큰 문제가 될 수 있다.
Differentiation systems
예전부터 분화 프로토콜은 심장, 간, 췌장 및 신경 세포와 같이 질병 관련 세포 유형에 중점을 두어, 이러한 세포 유형으로의 분화를 위한 완전한 솔루션을 상업적으로 이용할 수 있게 하는 데에 초점을 맞추고 있었다. 이러한 솔루션 중에서, 배아 발달과 유사하게 엄격하게 제어되고, 단계적으로 분화하는 강력하고 검증된 프로토콜을 선택해야 한다. 분화 후에는 원하는 변형이 포함된 완전히 분화된 세포가 90% 이상 포함된 집단을 얻는 것을 목표로 해야 한다.
이러한 각 질병 모델 개발 단계가 성공적으로 실행되면, 변형되고 분화된 세포를 통해 새로운 약물을 스크리닝하고, 질병 메커니즘을 이해하고, 치료법을 개발하는 보람 있는 작업을 수행할 수 있다. 유전자 편집 및 줄기 세포 분야에서 진행 중인 모든 혁신과 계획하고 있는 실험을 통해 어떤 새로운 기술이 실제 연구에 도입될지, 환자의 건강에 어떤 진전이 이루어질지 생각하는 것은 매우 흥미로울 것이다.
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