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제품설명
Bacillus subtilis를 숙주로 하는 재조합 단백질의 생산은 가용화 발현 및 분비 발현에 적합하며, 특히 S-S결합과 같이 복잡한 구조를 가지는 단백질의 생산에 효과적이다. 또한, E. coli를 숙주로 하는 발현계와는 달리 엔도톡신 (endotoxin)이 생산 단백질에 혼입되지 않는 장점도 있다. 반면에 이종 단백질의 분비 효율은 시그널 펩티드 타입에 크게 영향을 준다는 것이 T. Eggert 그룹에 의해 보고되고 있다.
이에 다카라는 B. subtilis의 효율적인 분비 발현계를 스크리닝/구축하기 위한 시스템을 개발하였다. 본 시스템을 이용하면 B. subtilis에서 유래한 173종류의 분비 시그널 펩티드에서 목적 단백질의 분비 발현에 적합한 시그널 펩티드를 스크리닝 할 수 있다. 기존의 B. subtilis plasmid는 copy 수가 매우 적어 B. subtilis에서 plasmid 구축이 어려운 단점이 있었지만, 본 시스템의 pBE-S DNA는 E. coli와 B. subtilis의 shuttle vector로 E. coli에서 plasmid를 구축할 수 있다.
본 제품은 B. subtilis 분비 시그널 펩티드 DNA library인 SP DNA mixture, B. subtilis - E. coli shuttle vector인 pBE-S DNA 및 단백질 발현용 숙주 B. subtilis RIK1285가 포함되어 있다. SP DNA mixture는 173종류의 B. subtilis유래 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA단편 (In-Fusion Cloning용)의 혼합물로 목적유전자를 삽입한 후, 당사의 In-Fusion Cloning 기술을 적용하여 손쉽게 분비 시그널 펩타이드를 추가, 최종 library를 구축할 수 있다. pBE-S DNA에는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110유래의 복제ori (pUB ori)와 kanamycin 내성유전자 (Kanr), E. coli에서 작동하는 pUC유래의 복제ori (ColE1 ori)과 ampicillin내성유전자 (Ampr)가 포함되어 있다. 또한 B. subtilis 유래의 subtilisin promoter (aprE promoter)와 분비 시그널 펩티드 (aprE SP)를 포함하고, 그 하류에 multicloning site (MCS) 및 His tag 서열이 배치되어 있다.
MCS에 목적유전자를 삽입한 pBE-S DNA를 제한효소 Mlu I와 Eco52 I로 절단하여 선형화한 후, In-Fusion Cloning system으로 aprE SP 대신 SP DNA mixture에 포함된 173종의 분비 시그널 펩티드 DNA library를 도입하여 (그림 참조), 목적 단백질에 적합한 고분비 발현계를 스크리닝이 가능하다. MCS는 E. coli Cold shock expression용 pCold™ vector (Code 3360, 3365, 3371 외)와 같은 서열이므로 쉽게 목적유전자를 삽입할 수 있다.
본 제품에 포함된 숙주 B. subtilis RIK1285는 2종류의 protease 생산능력이 없기 때문에, 목적 단백질의 분비 발현에 적합하다.
구성 (Library 10회 제작분)

1.

SP DNA mixture (0.032 pmol/㎕) *1

45 ㎕

2.

pBE-S DNA (0.5 μg/㎕) *2

20 ㎕

3.

B. subtilis RIK1285 (glycerol stock) *3

100 ㎕×2

*1 In - Fusion cloning을 위한 173 종 B. subtilis 분비 시그널 펩타이드 DNA
*2 형상: TE buffer (pH8.0)
*3 Marburg 168 derivative: trpC2, lys1, aprE Δ3, nprR2, nprE18
보존
- 80 ℃
(SP DNA mixture 및 pBE-S DNA는 -20℃에서 보존 가능)
pBE-S DNA vector map
Sequence 정보
- pBE-S Vector
- SP DNA Mixture
사용상의 주의
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