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All About Adeno-Associated Virus

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Adeno-Associated Virus (AAV)는 Parvovirus 과의 Dependovirus 속에 포함되는 non-envelope 바이러스이다. AAV는 사람에게는 면역원성이 없는 것으로 알려져 있으며, adenovirus
또는 herpesvirus와 같은 helper virus 존재시에만 증식이 가능하다.
AAV의 genome은 선형의 single-strand DNA로 길이는 약 4.7kb이다. AAV genome의 양 말단에는 inverted terminal repeats (ITRs)로 불리는 hairpin 구조가 존재한다. ITR은 AAV genome의 복제와 AAV particle의 packaging에 관여한다.
AAV는 100개 이상의 serotype이 존재하며, serotype에 따라 종 및 조직에 대한 감염 특이성 및 특징이 다르다. 다카라바이오는 AAV 연구에 가장 일반적으로 사용되는 4개의 serotype (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6)에 대한 제품을 제공하고 있다. AAV2는 AAV를 활용한 연구 (예; 유전자 치료제)에 가장 많이 사용되며 다양한 종과 조직에 대해 감염능력을 가지는 특징이 있다. 반면, AAV1, AAV5, AAV6은 높은 조직감염 특이성을 가지고 있다. AAV1은 근육과 간, 호흡기, 중앙신경계에, AAV5는 중앙신경계, 간, 망막에, AAV6는 심장, 근육, 간에 감염성이
높은 것으로 알려졌다. (표 1. 참조)
Adeno-associated virus (AAV)는 세포와 조직에 대해 유전자 도입 효율이 높아, 유전자도입의 도구 또는 유전자치료의 도구로 사용되며, Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus보다 안전하다고 알려져있다. AAV는 분열세포와 비분열세포에 대해 모두 감염 가능하며, 특히, 비분열세포에서는 장기간 유전자발현이 가능하다.

Serotype

주요 감염 조직

AAV1

근육, 간, 기도, 중추 신경계

AAV2

광범위한 세포·조직

AAV5

중추 신경계, 간, 망막

AAV6

심장, 근육, 간

표 1. AAV의 serotype에 따른 주요 감염 조직

【참고문헌】 
J Nippon Med Sch. 2012;79(6):394-402. 
Virol J. 2013 Mar 6;10:74 
- AAV벡터의 개발과 유전자 치료에 응용: 단백질 핵산 효소 Vol.52 No.10 (2007) 1288-1293 
※ 유전자 도입효율은 각 실험조건에 따라 달라질 수 있으므로 관련문헌을 참조하기 바랍니다.

AAV의 특징

  • AAV vector는 숙주 genome으로 삽입 (integration) 되지 않음
  • 분열세포나 비분열세포 모두에 적용 가능
  • 비분열세포에서는 장기간 유전자 발현 가능
  • 낮은 면역원성으로 in-vivo 유전자 도입 실험에 최적

다카라에서는 Serotype 1, 2, 5, 6의 AAV를 helper virus없이 안전하게 제작하기 위한 AAVpro® Helper Free System과 함께 AAVpro® CRISPR/Cas9, Tet-One 시스템 등
다양한 AAV 시스템을 제공하고 있다. 또한, AAV의 역가 향상을 위한 전용 Transfection 시약과 Packaging cell line, packaging cell line으로부터 AAV를 효율적으로 추출하기 위한 AAVpro® Extraction Solution, 고순도 AAV 정제를 위한 AAVpro® Purification Kit (All serotype, AAV2), 빠르고 간편하게 AAV의 역가 측정을 위한 Real Time PCR 방식의 AAVpro® Titration Kit 등 AAV 실험에 필요한 다양한 제품을 공급하고 있다.
이러한 다카라의 AAVpro® 제품을 이용하면, 효율적인 transduction을 위한 AAV를 고역가로 생산, 추출, 정제 및 titration 할 수 있다. AAVpro® 시스템으로 제작된 AAV는 동물
세포나 각각의 동물개체의 유전자 도입 (in vivo transduction)에 이용할 수 있다.


그림 1. Workflow of AAV

Takara Adeno-Associated Virus 관련제품
AAVpro® 시리즈


1. Helper virus없이 안전하게 고역가의 AAV 제작
AAVpro® Helper Free System (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6) (Code 6230 외)

  • Helper virus를 사용하지 않고, 안전하게 AAV1, 2, 5, 6 제작 (Helper Free System)
  • AAV2 system은 hsa-miR-342 탑재한 vector 사용으로 고역가 바이러스 제작 가능
  • 독자적인 AAVpro® Extraction Solution을 이용한 효율적이고 간편한 AAV vector 추출
  • 다양한 Application 적용: CRISPR/Cas9, Tet-Inducible, CRE Recombinase system 제공



그림 2. Human miRNA-342 (miR-342)가 AAV2 역가 향상에 미치는 효과. HEK293 세포에서 생산된 AAV의 역가를 Real Time PCR (total vector genome; vg)로 측정한 결과, human miR-342가 발현되는 시스템에서 생산된 AAV의 역가가 약 2배가량 높았다.

2. AAV 생산에 최적화된 Transfection Reagent
TransIT-VirusGEN® (Code MIR 6700)
  • 높은 활성을 가지는 고품질의 Adeno associated virus (AAV) 생산
  • Transfection reagent 변경으로 AAV titer 최대 2배 증가 가능
  • HEK293T의 adherent 또는 suspension 세포 모두 적용 가능


그림 3. Functional titer가 뛰어난 AAV 생산. AAV 생산을 위해 adherent 및 suspension cell에 각각의 transfection reagent를 사용하여 AAV packaging vector를 transfection 후, 생산된 AAV를 HT1080세포에 감염시켰다. 48시간 후 GFP발현을 유세포측정기로 측정 (n=3)하여 AAV의 functional titer를 비교해본 결과, TransIT-VirusGEN®를 사용하여 생산된 AAV가 가장 높은 functional titer를 나타내었다.

3. AAV 생산에 최적화된 Packaging cell
AAVpro® 293T Cell Line (Code 632273)


그림 4. 높은 titer의 AAV를 생산하는 AAVpro® 293T cell line. 3종류의 packaing cell line을 사용하여 AAV2를 제작 (AAVpro® Helper Free System (AAV2) 사용)한 결과, AAVpro® 293T Cell Line에서 가장 높은 역가의 AAV2가 생산됨을 확인하였다.

4. Packaging cell로부터 간편하고 효율적인 AAV 추출
AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)

일반적으로 AAV를 packaging cell로부터 추출하기 위해서는 사용하는 freeze/thaw, sonication등 특별한 장비가 필요하고 시간이 많이 소요되는 단점이 있다. 하지만, AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)은 간편하고 효율적으로 AAV를 추출할 수 있다.
  • 기존의 freeze-thaw 방법에 비해 최소 3배 이상 높은 회수율
  • Packaging cell유래 DNA 및 단백질 오염 최소화
  • 목적세포 감염 또는 In-vivo 실험*을 위한 AAV 정제에 적합
    *in vivo 유전자 도입을 위해서는 AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666) 또는 AAVpro® Purification Kit (AAV2) (Code 6232) 추천


그림 5. AAV의 추출효율 비교. AAVpro® Extraction Solution (남색)과 freeze-thaw 방법 (분홍색)을 이용해 추출한 AAV 의 역가를 Real Time PCR로 측정. 다양한 serotype에서 AAVpro® Extraction Solution를 사용한 AAV의 추출 효율이 높은것으로 확인되었다.

5. 초고속 원심분리기 없이, 빠르고 간편하게 AAV 정제
AAVpro® Purification Kit (All serotypes, AAV2)

높은 효율로 동물 및 세포에 유전자를 도입하기 위해서는 AAV의 면역 반응을 일으키는 불순물의 제거가 무엇보다 중요하다. 일반적으로 쓰이는 초고속원심분리기를 이용한 방법은 시간이 많이 소요되고, 수율을 높이기 위해서 정밀한 조작이 필요하다.  AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666) 또는 AAVpro® Purification Kit (AAV2) (Code 6232)를 이용하면 간단하고 빠르게 (4시간 이내) AAV를 고순도로 정제할 수 있다.

  • 빠르고 간편한 AAV의 정제 - Ultracentrifuge 사용 없이, 4시간만에 정제 완료
  • 정제된 AAV in vivo 적용 가능 - 마우스 brain 유전자 도입 예 (국문/영문)
  • 독자적인 AAV 추출법 사용, freeze/thaw, sonication 불필요 (특허 출원 중)
  • AAV의 serotype에 따라 선택해서 사용 - AAV2 전용 또는 All serotype 용
  • Packaging cell line에서 AAV 추출부터 정제까지 모든 구성품 포함


그림 6. AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666)으로 정제된 다양한 serotype의 AAV의 감염능력 확인


그림 7. AAVpro® Purification Kit (AAV2) (Code 6232) 의 정제효율 (A)과 순도 (B) 비교. AAVpro® Purification Kit (AAV2)과 B사, C사의 purification kit을 사용하여 AAV2의 정제효율, 순도를 비교하였다. 정제된 AAV2를 qPCR로 정량하여 정제효율 (A)과, SDS-PAGE로 순도 (B)를 비교해본 결과 AAVpro® Purification Kit (AAV2)의 정제효율과 순도가 높은 것이 확인되었다.

[AAVpro® Purification Kit (AAV2) (Code 6232) 사용방법 보기] 6. qPCR을 이용한 빠르고 정확한 AAV 역가 측정

AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver2. (Code 6233)
  • ITR (Inverted Terminal Repeat)*를 타겟하므로, vector 서열이나 serotype에 관계없이 적용 가능
  • 기존의 DNA blot 또는 ELISA 방법보다 정확한 정량
    * 본 제품은 AAV2 유래한 ITR을 타겟으로 정량하므로, AAV2 유래의 ITR을 가진 AAV면 serotype에 관계없이 사용 가능하다.




그림 8. ITR과 CMV promoter region을 qPCR 방식으로 AAV 역가 측정. ITR과 CMV promoter를 타겟으로 한 qPCR 결과는 거의 동일한 결과값을 나타내었다.