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Home > 전제품보기 > Cloning 관련 > In-Fusion Cloning > [Overview] In-Fusion® Cloning

[Overview] In-Fusion® Cloning

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[Overview] In-Fusion® Cloning



1. In-Fusion® cloning 기술 개요
Ligation-independent cloning (LIC) 방법 중의 하나로써, 3’ → 5’ exonuclease 활성을 가지는 In-Fusion® 효소를 이용해 DNA 단편 간의 상동서열 (약 15 bp)를 융합시켜 cloning하는 기술로, ligase 없이도 쉽고 정확하게 seamless한 산물을 얻을 수 있다.

2. In-Fusion® cloning 특징

반응 시간

  • 실험 디자인에 관계없이, 모두 15분 반응으로 완료
    (Single fragment cloning, multiple fragment cloning 등)
  • PCR 시 추가된 insert의 A 1염기 제거 등의 과정 없이 바로 적용 가능
  • Subcloning 과정 없이, 원하는 vector에 바로 삽입

효율

  • Single insert cloning: 95 ~ 100%의 수율
  • Multiple insert cloning: 90 ~ 100%의 수율
  • Vector나 insert의 크기에 상관없이, 곧바로 cloning 가능

활용성



3. In-Fusion® cloning 실험 과정


4. In-Fusion® cloning primer design
In-Fusion® Cloning을 위해서는 insert 양 말단에 vector 상동 서열을 부가하는 과정이 필요하며, single insert의 경우 15 bp, multiple insert의 경우 20 bp를 추천한다.
PCR primer는 gene specific sequence*와 vector 상동서열을 포함하도록 제작하며, 각 vector 말단의 형상에 따라 primer를 디자인한다.

* Gene specific sequence의 자세한 조건은 매뉴얼을 참조하시오.
* In-Fusion® primer 디자인 툴 (클릭)


5. In-Fusion® cloning 제품 선택가이드

특징

In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947 외)

In-Fusion® Snap Assembly EcoDry™ Master Mix (Code 638954 외)

형태

액상

동결 건조

Control vector, insert 포함

O

O

원하는 reaction volume 혹은 plate/tube 등에서 사용

O

 

HTP 적용을 위한 편리한 scale up

O

O

1회분으로 분주 및 동결 건조되어, handling error 최소화

 

O

실온에서 보관 가능

 

O



6. 타 PCR cloning 방식과의 비교 (vs. Gibson assembly)

 

In-Fusion® Snap Assembly

Gibson assembly-based cloning

Colony 수

다소 복잡한 실험 (예 - multiple cloning, large insert/vector 등)에서도 타 방식에 비해 colony가 많이 형성됨

복잡한 실험의 경우 colony가 적게 형성되거나, 형성되지 않음

Nick 수복 과정

Polymerase를 이용하지 않고, competent cell에서 nick을 수복하여, 이로 인한 불필요한 염기 추가 등의 에러 최소화

DNA polymerase가 enzyme mix 내 포함되어 있어, error가 수복 부위에서 발생할 수 있음.

Ligase를 사용하지 않아, self ligation 등의 백그라운드가 나타날 확률이 적음

in vitro ligation을 이용하므로, empty vector 등 백그라운드가 나타날 확률이 높음.

반응 시간

15 분

~ 60 분

A-overhang insert 교정

3’ → 5’ exonuclease 활성을 이용해, PCR 과정에서 임의로 부가된 A 1염기의 교정이 가능함

5’ → 3’ exonuclease 활성을 이용하기에, PCR 과정에서 임의로 부가된 A 1염기에 대한 교정이 불가능해, 정확도가 떨어짐

PCR primer 디자인

15 bp overlap으로, PCR 조건 설정 시 유리

일반적으로 20 ~ 30 bp overlap



7. 참고 자료