■ Human iPS 세포 배양의 과제
Human iPS 세포 (human induced pluripotent stem cells)는 human 체세포에 몇 가지 전사인자 (리프로그래밍 인자)를 도입하여 리프로그래밍함으로써 인위적으로 제작한 유도만능 줄기세포이다. hiPSC는 적절한 조건하에서 다양한 세포로 분화할 수 있는 다능성 (pluripotency)을 유지한 채 무한히 증식하는 자기 복제 능력을 가지고 있다. 이러한 능력을 안정적으로 유지하기 위해서는 적절한 배양 방법의 선택이 매우 중요하다.

■ Feeder cell를 이용한 기존의 human iPS 세포배양의 과제
Feeder cell를 이용한 기존의 hiPSC 배양법은 주로 mouse embryonic fibroblast (마우스 섬유아세포) 등이 feeder cell로 사용되었다. feeder cell는 hiPSC가 배양 플레이트 등에 접착할 수 있게 하는 지지체로 작용하는 것 외에도 세포의 증식이나 미분화성을 유지하는데 중요한 역할을 하지만, feeder cell을 이용한 배양법에서는 다음과 같은 과제들이 있다.

과제 1. 숙련된 기술 요구
기존 on-feeder 배양법은 iPSC를 콜로니 (세포 덩어리) 형태로 배양하는 방법이다 (그림 1, 2). 이러한 배양법은 hiPSC의 미분화성과 증식능을 유지하기 위해 콜로니를 적당한 크기로 맞춰 seeding 또는 동결보존할 필요가 있다.

그림 1. hiPSC 기존 배양법 (on-feeder 배양)의 한계

과제 2. Feeder cell 확보와 배양 전 준비 과정 필요
hiPSC의 on-feeder 배양법은 feeder cell인 mitomycin을 처리한 mouse embryonic fibroblast (마우스 섬유아세포) 등을 미리 배양 플레이트에 seeding하는 과정이 필요하다. 이러한 과정 때문에 feeder cell이 필요 없는 일반 세포 배양과 비교하여 hiPSC 배양이 복잡한 것은 물론 scale up이나 자동화에 한계가 있을 수 있다.

그림 2. On-feeder 배양한 hiPSC의 세포 형태

과제 3. 배양 환경의 robustness (견고성) 부족
과제 1, 2에서 언급한 바와 같이 숙련된 기술이 필요하며 일정한 품질 확보가 쉽지 않은 feeder cell을 사용하는 on-feeder 배양법에서는 ‘실험간 편차’나 ‘실험자 간 편차’가 hiPSC의 품질에 미치는 영향이 클 수 있다. 따라서 배양 이후 분화 유도 등의 실험에서 재현성이 저하될 우려가 있다.

과제 4. 이종 동물 유래 성분 사용
안전성이 중요시되는 재생 의료 분야에서는 이종 동물 유래의 feeder cell에서 기인한 성분 유입과 바이러스 감염 가능성이 있기 때문에, feeder cell을 필요로 하지 않는 배양법이 필요하다.

솔루션: feeder-free 배양법
이러한 과제를 해결하기 위해 최근 feeder cell이 필요 없는 feeder-free 배양법이 개발되고 있다.
Cellartis^® DEF-CS™ 500 Culture System（DEF-CS™ 배양 시스템; 그림 3의 왼쪽）도 이러한 feeder-free 배양 시스템의 하나로, feeder cell 대신 플레이트 코팅제를 사용하여, hiPSC이 갖고 있는 특징을 안정적으로 유지한다.

그림 3. DEF-CS™ 배양 시스템 (왼쪽)과 DEF-CS™ 배양 시스템을 사용하여 배양한 iPSC의 세포 형태 (오른쪽)

■ DEF-CS™ 배양 시스템의 특징
DEF-CS™ 배양 시스템은 다음 두 가지 특징을 통해 hiPSC를 일반 세포와 거의 동일한 배양 환경을 유지할 수 있다. On-feeder의 기존 배양법에 비해 간편하게 hiPSC의 배양 유지가 가능하며, 기존 배양법에서 문제가 될 수 있는 실험자 간의 편차와 실험 간 편차로 인한 결과 (hiPSC의 품질)의 불균형을 대폭 개선할 수 있다.

<특징 1> feeder-free 배양

<특징 2> 2D 배양으로 인한 single cell culture
DEF-CS™ 배양 시스템에서 배양한 hiPSC는 on-feeder 배양과 달리 콜로니를 형성하지 않고, monolayer의 균일한 세포 형태를 나타낸다 (그림 3의 오른쪽). 따라서 hiPSC 콜로니를 적당한 크기로 조절할 필요가 없으며, trypsin으로 single cell까지 분리한 상태 (그림 4)로 계대하거나 동결보존이 가능하다.

그림 4. DEF-CS™ 배양 시스템에서 배양한 hiPSC에 trypsin 처리 후 (왼쪽)과 세포수 측정 현미경 사진 (오른쪽)

■ DEF-CS™ 배양 시스템을 통한 우수한 hiPSC 품질 유지
DEF-CS™ 배양 시스템에서는 hiPSC 배양이 간편할 뿐 아니라, 「증식능」, 「미분화성」, 「다분화능」을 비롯한 hiPSC에 요구되는 특징이 안정적으로 유지됨을 확인하였다 (그림 5).

그림 5. DEF-CS™ 배양 시스템에 의한 hiPSC의 안정적 유지
A) 각종 배지에서 feeder-free 배양한 hiPS cell line (253G1)에 대해 장기 배양 테스트를 실시한 결과, DEF-CS™ 배양 시스템을 이용한 경우, 가장 양호한 증식이 확인되었다.
B) 각 조건에서 배양한 hiPS Cell line (16 passage 후)을 회수하고 미분화 마커로 알려진 TRA1-60 및 SSEA4에 대해 flow cytometer로 분석했다. DEF-CS™ 배양 시스템에서 배양한 hiPS 세포주는 on-feeder 배양한 hiPS 세포주와 마찬가지로 높은 TRA1-60 및 SSEA4의 양성률과 발현강도를 보이며, 극히 높은 수준으로 미분화성이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
C) DEF-CS™ 배양 시스템에서 배양한 hiPS 세포주는 전체 배엽 조직 (삼배엽)으로의 분화능을 유지하고 있었다.