■ Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)
96 well에서 Lentivirus를 생산하는 것은 CRISPR/Cas9 또는 sh-RNA 기반 스크리닝, vector 최적화 작업 등을 포함한 다양한 high-throughput 실험의 공통 출발점이다. 생산 과정에서 각 packaging 시약의 비율을 최적화하고 소량으로 분주하는 것은 high-throughput 상황에서 고역가의 바이러스를 얻는데 어려움을 줄 수 있다. 이러한 문제를 극복하고 생산과정을 간소화하기 위하여 당사에서는 범용적으로 사용되는 Lenti-X™ Packaging 시스템을 적용하여 96well plate 에서 고역가의 VSV-G-pseudotyed Lentivirus 생산이 가능한 시스템을 제공하고 있다.

Lenti-X™ Packaging Single Shots(96-well, VSV-G) (Code 631282)은 Xfect™ Transfection 시약과 Lenti-X™ packaging plasmid를 최적화된 비율로 96 well 플레이트에 분주하여 동결 건조 형태로 제공되는 제품으로 사용이 매우 용이하다.

• 쉽고 간단하게 high-throughput lentivirus 생산 가능 - expression vector를 각 well에 넣고 섞은 후 packaging cell에 넣어 바이러스 생산이 가능하며, transfection mix 제작과 분주에 쓰는 시간을 단축할 수 있다.
• 고역가 바이러스 생산 가능 - 당사의 시스템은 1×10⁷ - 1×10⁸ IFU/㎖의 역가를 보이며, expression vector의 농도가 낮거나, 최적 조건이 아닌 경우에도 사용 가능한 수준의 역가를 얻어낼 수 있다.
• well 과 제품 lot 간의 높은 균일성 - 연속되는 lot의 Lenti-X™ packing single shots (96-well, VSV-G) 성능시험 결과 well 간의 변동계수 (CV)가 15% 미만이었고, 이로 인해 모든 플레이트와 well에서 일관된 성능을 기대할 수 있다.

■ What is it?
이 제품은 호일 파우치에 개별 포장된 96 well 플레이트 4개가 제공된다. 플레이트는 각 well마다 동결건조된 Xfect™ Transfection 시약과 Lenti-X™ packaging plasmid가 일정하게 분주되어 있으며, 자동 분주기 (automated liquid handling platform)에 적용할 수 있도록 뚫을 수 있는 호일로 밀봉되어 있다.

그림 1. Lenti-X™ Packaging Single Shots 96-well Plate (VSV-G).

■ How does it work?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)은 high-throughput lentivirus 생산 방법을 간소화하며, 일반적으로 사용하는 대부분의 Lentivirus expression vector backbone과 호환된다.
따라서 단순히 각 well에 expression vector를 인코딩하는 plasmid 10 ㎕를 추가해 각 well에 미리 분주되어 있는 파우더를 용해시키기만 하면 된다. 생성된 나노입자 복합체 (nanoparticle complexes)는 다른 플레이트의 packaging cell (예 : Lenti-X™ 293T cells)에 transfection 하고, 48 ~72 시간 후 각 well의 상등액에서 고역가 Lentivirus를 회수하여 또다른 플레이트에서 표적 세포를 transduction하는 데 사용할 수 있다.


그림 2. Protocol for Lenti-X™ Packaging Single Shots 96-well Plate (VSV-G).

■ What are typical titers?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)은 최대 역가를 얻기 위하여 Takara Bio의 4세대 Lentivirus 패키징 시스템을 사용하며, 96 well 환경에서 일반적으로 1×107 - 1×108 IFU/㎖ 의 역가를 보인다 (그림 3 참고).


그림 3. Reliable high-titer lentivirus production with Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G).
사용자 매뉴얼에 따라 ZsGreen1을 발현하는 expression vector를 Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)의 각 well에 첨가하고 용해한 혼합물을 별도 플레이트의 Lenti-X™ 293T cell에 transfection 하였다. 37℃에서 밤새 배양 후 무작위로 선택한 4개 well을 형광 현미경으로 확인하였다 (패널 A). Transfection 48 시간 후, lentivirus 상등액을 serial dilution 하여 polybrene (6 ㎍/㎖)이 있는 별도 플레이트의 293T 표적세포에 transduction 하였다. Transduction 72시간 후 flow cytometry로 분석하였고, IFU (infectious unit)는 세포당 도입된 유전자가 1개 이하임을 확인하기 위해 10% 미만 효율로 transduction된 세포 집단을 가지고 계산하였다 (패널 B). 무작위로 선택한 각 4개 well의 바이러스 역가는 1×10⁷ IFU/㎖ 이상이었다.

■ How consistent are results?
High-throughput 실험 시 효율적으로 진행하고 실험 간의 오차를 방지하기 위해서 well 및 플레이트 간 성능이 일관되어야 한다. High-throughput lentivirus 생산을 위한 Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)의 신뢰성을 위해 서로 다른 생산 lot의 플레이트를 사용하여 well 간의 transfection 효율을 분석하였다.


그림 4. Consistent transfection efficiencies from well to well and lot to lot with Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G).
Transfection 혼합물은 ZsGreen1을 발현하는 expression vector와 두 개의 서로 다른 생산 lot을 가진 Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)를 사용해 준비하였다. Transfection 혼합물을 별도 플레이트에 있는 Lenti-X™ 293T cell에 처리하고 밤새 배양 후 GFP 발현을 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다 (패널 A : 각 well에 적용된 plasmid의 양은 ng 단위로 표시). 각각의 lot를 사용하여 40 ng의 plasmid (패널 A의 검은색 박스로 표시된 well)로 transfection된 세포에 대해 GFP 발현값과 평균값을 얻어 각각 lot과 well 간의 표준 편차와 변동 계수를 계산하였다 (패널 B : 각 lot n=72). GFP의 평균 발현 수준은 서로 다른 lot끼리 비슷했으며 well 간 변동계수 (CV)도 각 lot에 대해 15% 미만이었다.

■ How robust is the workflow?
Expression vector 농도의 정량 및 조정이 high-throughput 작업 처리에서 적용이 어려운 경우가 있기 때문에 항상 사용 가능한 수준의 역가를 생산하는 바이러스 시스템이 필요하다. 이것을 고려하면서 Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)을 사용 후, 바이러스 생산 역가를 다양한 plasmid 도입량에 따라 평가하였다.


그림 5. Usable viral titers from varying inputs of exprssion vector DNA.
Lenti-X™ 293T cell에 적용 전 Lenti-X™ Packaging Single Shots (96-well, VSV-G)을 사용하여 0 - 160 ng의 expression plasmid를 transfection 하였다. Transfection 효율은 형광현미경으로 분석하였고 (패널 A), expression plasmid의 투입량에 따른 바이러스의 역가는 Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit (Code 631235)를 사용해 측정하였다. 전체적인 투입량 범위에서 모두 사용 가능한 수준의 바이러스 역가가 얻어졌음을 알 수 있다.