센트럴 도그마(Central dogma)란?
프랜시스 크릭이 1957년 9월 19일에 발표한 이론으로 생명체의 유전 정보가 어떻게 전달되는지를 나타내는 분자생물학의 중심원리로서 DNA를 복제(Replication)를 하고 이를 주형으로 전사(Transcription)하면 RNA가 되며, RNA를 번역(Translation)하면 단백질(Protein)이 된다는 이론이다. 아래 그림에서 화살표는 유전 정보의 이동을 보여준다.



역전사(Reverse Transcription)란?
역전사(Reverse Transcription)는 RNA의 유전정보가 역전사효소에 의해 DNA로 전달되는 과정으로 역전사효소를 가지고 있는 레트로바이러스(Retrovirus)에서 발견된 현상이다. 일반적인 실험 (in vitro)에서는 in vitro에서 RNA 자체를 증폭할 수 없으므로 보다 안정적인 DNA로 역 전환하는 과정을 필요로 한다. 이 때, 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 DNA를 합성하는데, 이를 cDNA(complementary DNA)라 부르며, 이 합성된 cDNA를 주형으로 PCR하기 까지 과정 전체를 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)이라고 한다.

중합효소란?
중합효소 (polymerase)는 핵산의 중합 반응을 일으키는 효소로, 주형과 합성산물에 따라 크게 4가지 종류로 구분한다.

분류		주형	합성산물	대표적인 효소
DNA polymerase	① DNA-dependent	DNA	DNA	PCR 용 polymerase (Taq, Pfu 등)
	④ RNA-dependent	RNA	DNA	Reverse Transcriptase (RTase)
RNA polymerase	② DNA-dependent	DNA	RNA	SP6 & T7 RNA polymerase
	③ RNA-dependent	RNA	RNA	RNA replicase (RDRP)

① RNA
RNA의 순도는 RT를 비롯한 RNA 실험에서 가장 중요한 부분이다. 전기영동으로 RNA의 밴드를 확인하거나, Nano-Drop으로 측정하여 OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 1.8, OD₂₆₀/OD₂₃₀ > 1.6 값을 확인한다. Bioanalyzer에서는 RIN(RNA integrity number) 값을 얻을 수 있으며, 1~10까지의 값으로 RIN 값이 10과 가까울수록 intact한 RNA이며, 일반적으로 RNA Ratio (28S/18S) > 1.5 이면서 RIN 값 7 이상의 RNA가 후속실험에 사용하기 적절한 퀄리티라고 여겨진다.
원핵생물의 경우 전사된 RNA가 바로 번역되지만, 진핵생물의 경우 유전정보를 가지는 mRNA(messenger RNA)의 정사 후 가공과정을 거쳐 중간중간 위치한 인트론(intron)을 제거하고 엑손(exon)만 남긴다. 이 때, capping 및 splicing 과 mRNA 3’ 말단에 poly(A) tail 구조가 추가되는데, 이런 poly(A) tail이 mRNA의 가장 특징적인 구조이다. 따라서 이 구조를 이용하여 진핵생물의 mRNA만을 이용한 RT가 가능하다.

② RTase, reaction buffer
역전사효소는 RNA를 유전체로 가지는 RNA virus가 증식을 위해, 자신의 RNA를 감염체의 염색체로 삽입하기 위해 가지고 있는 효소다. 현재 실험실에서 가장 많이 사용되는 역전사효소에는 AMV(Avian Myeroblastosis virus)와 MMLV(Moloney Murine Leukemia virus)에서 유래한 2종이 있다.
AMV는 MMLV 효소보다 비교적 높은 온도인 42 ℃에서 활성을 나타내어, 고차구조를 포함한 다양한 주형이 적용가능하지만, 강력한 RNase H의 활성을 가지고 있어 합성 효율이 낮을 수도 있다. 반면 MMLV는 RNase H 활성이 비교적 약해 긴 DNA 합성이 가능한 장점이 있지만, 반응 최적온도가 37 ℃로 주형 mRNA가 복잡한 고차구조를 가지는 경우, cDNA extension이 저해될 수도 있다.
기존에는 고차구조를 포함한 다양한 mRNA에서 합성하기 위하여 열안정성이 높은 AMV RTase가 주로 사용되었지만, 최근 MMLV 유래의 개량형 효소(e.g. PrimeScript™ RTase)의 성능이 향상되면서 MMLV 유래의 역전사 효소 사용이 주류를 이루고 있다.

	AMV RTase	MMLV RTase
분류	RTase (RNA-dependent DNA polymerase)
주형	ssRNA, ssDNA
활성 적정 pH	8.3	7.6
3’ to 5’ exonuclease activity	X
활성 적정 온도	42 ~ 60 ℃	37 ~ 42 ℃
RNase H activity	매우 높음	높음
Processivity	매우 낮음 (short cDNA 합성)	낮음 (long cDNA 합성)

③ Primer
역전사효소를 이용한 cDNA 합성에는 annealing 위치와 목적에 따라 3종류의 primer를 사용할 수 있다.
· Oligo dT primer: 진핵세포 mRNA의 poly A tail에 annealing 되어, 3’ 말단에서부터 cDNA를 합성
· Random primer: 일반적으로 6nt~9nt 정도로 RNA의 모든 영역에서 cDNA 합성을 시작
· Gene specific primer: 타겟하는 영역의 cDNA만을 합성

④ dNTP mixture
Reverse transcriptase의 기질로서 RNA를 주형으로 cDNA가 합성되도록 하는 주재료이다.

⑤ RNase inhibitor
역전사 과정에서 RNase의 작용을 억제하여 RNA degradation없이 주형으로 적절히 활용될 수 있게 한다.
RT 반응과정
→ PrimeScript™ Reverse Transcriptase (Code 2680A) 사용의 경우

Perfect cDNA 합성을 위한 보조 제품
Code	제품명	용량
9037	RNase-OFF™ (RNase Contamination 제거 용액)	500 ㎖
9036	DNA-OFF™ (DNA Contamination 제거 용액)	500 ㎖
2270A	Recombinant DNase I (RNase-free)	1,000 U
2313A	Recombinant RNase Inhibitor	5,000 U

합성한 cDNA를 이용하는 후속 실험 및 application
● RT-(q)PCR     ● Cloning     ● NGS      ● 단백질 발현

Code	제품명	특징	용량
Full length cDNA 합성
6215A	PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix	반응시간도 짧은 최적 조합의 5x premix	50 회
6110A	PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit	RT 구성품이 모두 포함된 all-in-one-kit	50 회
6210A	PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit	고차구조 RNA 적용성 강화	50 회
2680A	PrimeScript™ Reverse Transcriptase	역전사 효소와 buffer 구성	10,000 U
Real Time PCR 전용 cDNA 합성
RR092A	PrimeScript™ FAST RT reagent Kit with gDNA Eraser	gDNA 2분 제거, 10분 RT premix	100 회 (20 ㎕)
RR036A	PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)	저농도 샘플 5x premix	200 회 (10 ㎕)
RR037A	PrimeScript™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time)	베이직 - 15분 RT 완료	200 회 (10 ㎕)

NGS에 사용되는 고감도 RTase

Code	제품명	특징	용량
Bias 없는 full-length cDNA 합성
639536	SMARTScribe™ Reverse Transcriptase	Takara SMART® 기술 기반 NGS kit 제품 구성품, long&full length cDNA 합성	40 회
634925	SMARTer® PCR cDNA Synthesis Kit	Takara SMART® 기술을 이용하여 극소량 RNA에서 ds cDNA 합성	40 회

동결건조타입 EcoDry™ RT Premix

Code	제품명	특징	용량
동결건조된 master mix로 1st strand cDNA를 합성
639543	RNA to cDNA EcoDry™ Premix (Oligo dT)	· 실온보관 가능 동결건조 시약 · 8-strip well tube 에 1회씩 분주	24 회
639546	RNA to cDNA EcoDry™ Premix (Random Hexamers)		24 회
639549	RNA to cDNA EcoDry™ Premix (Double Primed)		24 회
EcoDry™ RT premix에 사용되는 초고순도 RTase
639522	SMART™ MMLV Reverse Transcriptase	고품질의 full length cDNA를 합성	2,000 U