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Home > 전제품보기 > Genome Editing > CRISPR-Cas9 gene delivery > Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System
Off-target effect 감소, Hard-to-transfect cell line을 위한 CRISPR/Cas9

Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Clontech
632613
Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System
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1 Kit
1,267,000원  제조사 페이지로 바로가기 114341
Clontech
632616
Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set
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1 Set
1,084,000원  제조사 페이지로 바로가기 114341
Clontech
632617
Gesicle Producer 293T Cell Line
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1 ml
541,000원  제조사 페이지로 바로가기 114341
Clontech
632612
pGuide-it-sgRNA1 Vector System
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1 Kit
595,000원  제조사 페이지로 바로가기 114341

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle 실험 원리 및 개요 (클릭)

  • Cell-derived nanovesicle(Gesicle)을 이용하여 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein(RNP)를 세포 내 직접 도입
  • Broad tropism: 다양한 Cell line에 적용 가능
  • Hard-to-transfection cell line (분열세포, 비분열세포, iPS 세포)에서도 효율적인 CRISPR/Cas9 Genome Editing 가능
  • Off-target effect 최소화: 도입된 Cas9/sgRNA Complex는 세포 내에서 신속하게 제거되어 Off-target effect를 줄일 수 있음
제품설명
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production system은 Cas9/sgRNA Complex를 세포에 효율적으로 도입하기 위한 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작하는 제품이다. Cas9/sgRNA Gesicle을 이용하면 Plasmid transfection이나 Virus transduction을 이용한 Genome Editing과 비교하여 더욱 다양한 세포주에 효율적으로 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP)를 도입할 수 있다.
본 시스템에서는 target DNA specific-sgRNA를 발현하는 CRISRP/Cas9 plasmid를 Gesicle 제작용 세포인 Gesicle Producer 293T Cell Line (Code 632617)에 transfection하여 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작한다.

Cas9/sgRNA Gescle 생성에 필요한 시약은 2개의 튜브에 동결건조 상태로 제공되며, sgRNA를 클로닝한 pGuide-it sgRNA1 Vector를 튜브에 첨가 후, 혼합물을 Gesicle Producer 293T Cell Line에 transfection함으로써 간단하게 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작할 수 있다.
CRISPR/Cas9 Gesicle의 원리
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System은 고농도의 Cas9/sgRNA를 포함한 Gesicle을 제작한다. Gesicle에는 Cas9 단백질, target specific sgRNA, CherryPicker Red Fluorosence protein, Glycoprotein으로 구성되어있다.

① sgRNA 서열을 삽입한 pGuide-it-sgRNA1 vector를 Gesicle Packaging Mix1과 Mix2를 이용하여 Gesicle Producer 293T Cell Line에 transfection하면 Gesicle Producer 293T Cell membrane에 Glycoprotein이 생성된다.
② 이 때, iDimerize 기술에 의하여 Cas9단백질/sgRNA complex와 CherryPicker 형광단백질이 Gesicle내에서 상호작용하게 되며, Gesicle 내로 봉입, 세포 외로 방출된다.
③ 배양액으로부터 회수한 Geiscle을 목적세포에 첨가하면 Gesicle이 세포막과 융합되어 Cas9/sgRNA Complex가 목적세로 내부로 방출된다.
④ NLS Tagging에 의하여 Cas9/sgRNA Complex는 목적세포의 핵 내부로 이동하며, 핵 내에서 Genome DNA의 target gene을 절단한다. 이 때, Gesicle에 포함되어있는 CherryPicker 형광단백질로 Cas9/sgRNA complex의 세포 내 도입을 모니터링할 수 있다.


그림 1. Cas9/sgRNA Gesicle의 제작과 세포 내 도입 원리


그림 2. Cas9/sgRNA Gesicle에 의한 다양한 세포의 Knock-out 효율

Cas9/sgRNA Gesicle을 이용하여 각 세포주에서 Zs-Green1을 Knock-out하였다. ZsGreen1 형광단백질을 목적으로 제작된 Cas9/sgRNA Gesicle 처리 (각각 10ul, 20ul, 30ul 첨가) 또는 CRISPR/Cas9 plasmid transfection하여 Knock-out 효율을 비교하였다. Cas9/sgRNA Gesicle을 이용할 경우 transfection 효율이 낮은 세포에 대하여 일정한 제거 효율을 얻을 수 있었다.


그림 3. Cas9-sgRNA gesicle을 사용한 endogenous protein(CD81) Knock-out


그림 4. hiPS세포에서의 CD81의 Knock-out

Human CD81 specific sgRNA를 포함한 Cas9/sgRNA Gesicle을 Gesicle Producer 293T Cell Line에서 제작하였다. Cellartis DEF-CS Culture System (Code Y30010)을 이용하여 미분화 상태로 배양한 Cellartis human iPS cell line 18 (ChiPSC18) Kit (Code Y00305)에 Cas9/sgRNA Gesicle을 첨가하였다. 배양 6시간 후, 새로운 DEF-CS 배지로 교환 후, 약 7일간 배양하였다. 배양 후 iPS 세포의 Knockout 효율 및 미분화 유지 상태를 확인하기 위하여 CD81을 표지하는 FITC-labeled antibody, SSEA4 (iPS세포의 미분화상태 표지마커)를 인식하는 PE표지 항체를 각각 사용하여 Flowcytometry로 분석하였다. Panel A는 Gesicle을 처리하지 않은 Cellartis human iPS cell line 18 (ChiPSC18) Kit (Code Y00305)을 FITC-labeled CD81 항체로 표지한 것, B는 CD81을 타겟하는 Gesicle을 처리한 세포주를 FITC-labeled CD81항체로 표지한 결과이며, C는 Gesicle을 처리하지 않은 세포주에 FITC-labeled CD81 Ab와 SSEA4 항체로 표지, D는 Gesicle을 처리한 세포주에 FITC-labeled CD81 Ab와 SSEA4 항체로 표지한 분석 결과이다. Cas9/sgRNA Gesicle을 처리함으로써 약 10%의 CD81 Knockout 효율이 확인되었다 (Panel B).
적용
  • CRISPR/Cas9-mediated gene editing
  • Stem cell research
구성품 (자세한 내용은 CoA를 참조하세요)
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code 632613)
1.

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set (Code 632616)

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1(green cap)
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2(yellow cap)
A/C Heterodimerizer(500 nM in Ethanol)
Protamine Sulfate(4 mg/ml)

10 vials
10 vials
50μ l
200μ l

2.

Guide-it sgRNA Vector System (Code 632612)

a. pGuide-it-sgRNA1 Vector(Linear)(7.5 ng/μ l)

12μ l

 

b. Guide-it Ligation Components v2

DNA Ligation Mighty Mix
Guide-it Oligo Annealing Buffer
Guide-it Control Annealed Oligos v2(100 fmol/μ l)
Guide-it Sequencing Primer 1(100 pmol/μ l)
PCR-Grade Water

50μ l
1.5 ml
10μ l
10μ l
1 ml

 

c. Stellar Competent Cells (Code 636763)

Stellar Competent Cells(100μ l/tube)
SOC Medium(1 ml/tube)
pUC19 Vector(0.1 ng/μ l)

10 tubes
10 tubes
10μ l

Gesicle Producer 293T Cell Line (Code 632617)

Gesicle Producer 293T Cell Line

1 ml

보존
Stellar Competent Cells:-80℃
기타: -20℃

Gesicle Producer 293T Cell Line: 액체질소(-196°C) 또는 -150℃ freezer에 보관

Keyword :
-
CRISPR-Cas9 gene delivery
Single vector를 이용한 효율적인 sgRNA, Cas9 발현
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