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SaCas9를 이용한 AAV mediated CRISPR Genome Editing (Single vector)

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Clontech
632619
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)
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※ SpCas9 (from S.pyogenes) 를 이용한 AAV meditated CRISPR/Cas9 Genome Editing은 AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) (Code 632608) (Two vector system)을 확인하세요.
  • Staphylococcus aureus 유래의 SaCas9를 이용한 One vector CRISPR/SaCas9 System
  • Adeno-associated virus (AAV)를 이용하여 SaCas9과 sgRNA를 세포 내 도입
  • Transfection이 어려운 Mammlian cell (분열, 비분열세포)에서 Genome Editing
  • AAV에 의한 Cas9 도입은 genome integration을 억제하고 Cas9의 발현을 지속시킬 뿐만 아니라, off-target effect를 억제
제품설명
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System은 single guide RNA (sgRNA)와 SaCas9 (from Staphylococcus aureus) 유전자를 발현하는 Adeno-associated virus 2 (AAV2) particles를 Helper virus 없이 제작 가능한 제품이다. 본 제품은 S.aureus 유래의 SaCas9과 sgRNA를 하나의 벡터에서 발현할 수 있는 single vector system이다 (그림 1).
S.aureus 유래의 SaCas9 nuclease의 유전자 크기는 3.3 kb로써, 기존에 사용되어왔던 Streptococcus pyogenes 유래의 SpCas9 nuclease (4.1 kb) (보통 Cas9이라고 명명함) 보다 약 1 kb 정도 작다. 그렇기 때문에 하나의 AAV vector에 sgRNA 발현 유전자와 SpCas9 발현 유전자를 한꺼번에 삽입이 가능하게 되었으며, 이는 in vitroin vivo에서 다양한 세포에서 효율적으로 Genome editing이 가능하다. 반면, SaCas9의 경우 SpCas9과 PAM 서열 (Proto-Spacer Adjacent Motif) 및 target sequence의 길이 (20 - 22 nt)가 다르므로 sgRNA 디자인 단계를 고려할 필요가 있다 (그림 2).
본 제품에 포함되어 있는 SaCas9/sgRNA 발현 AAV vector, AAV packaging에 필요한 pRC2-mi342 vector 및 pHelper vector를 HEK293T 세포주에 도입을 하면, Helper virus 없이 고순도 및 높은 Titer의 AAV particle을 얻을 수 있다. 본 제품에는 AAV production 및 CRISPR Genome editing을 위한 모든 제품 (Ligation mix, Stellar™ Competent cells, AAV Extraction buffer 등)이 포함 되어있다.


그림 1. pAAV-Guide-it-1 vector의 SaCas9과 sgRNA 발현
pAAV-Guide-it-1 vector를 패키징하고 있는 AAV particle을 Target cell line에 transduction함으로써, SaCas9 단백질과 sgRNA 유전자가 동시에 함께 발현된다.



그림 2. SaCas9의 PAM sequence
SaCas9의 PAM 서열은 NNGRR (N=A, T, G, C / R=A/T)이며, PAM으로부터 3 - 4 bp의 염기를 절단한다. 또한, sgRNA의 Target sequence는 20 - 22nt를 권장한다. SaCas9의 sgRNA 디자인은 http://benchling.com에서 가능하다.



그림 3. AAV를 이용한 SaCas9과 SpCas9의 Genome editing 효율 비교
CYP2 Exon1 유전자 중, 2개의 다른 배열을 editing 표적으로 하여 Two vector system인 AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) (Code 632608) 과 Sinlge vector system인 AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2) (Code 632619)를 사용하여 AAV mediated CRISRP/Cas9 editing을 수행하였다. 12-well plate에 1 x 105개의 세포를 seeding, over night 배양 후, SpCas9 or SaCas9 virus vector를 1 x 105 MOI로 감염시켰다. 72시간 후, 세포를 회수하고 Genome DNA 변이도입 효율을 Guide-it™ Mutation Detection Kit (Code 631443)을 사용하여 분석 및 비교하였다.
Applications
AAV-based delivery of a user-defined sgRNA and Cas9 for mammalian genome editing using CRISPR/Cas9 technology
구성품 (자세한 내용은 CoA를 참조하세요)
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2) (Cat. No. 632619)
  • AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
  • Guide-it™ Ligation Components
  • Stellar™ Competent Cells
  • pRC2-mi342 Vector
  • pHelper Vector
  • AAVpro® Extraction Solution

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector System (Cat. No. 632618)
  • AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
  • Guide-it™ Ligation Components
  • Stellar™ Competent Cells
보존
Stellar™ Competent Cells: -80 ℃
기타: -20 ℃
(AAVpro® Extraction Solution은 융해 후, 실온 보관)

Keyword : AAV,CRISPR/Cas9,CRISPR,SaCas9 Genome editing
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