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cDNA Library 구축 All-in-One Kit

cDNA Library Construction Kit

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제품설명

진핵 생물의 다양한 조직이나 세포에서 Poly A⁺ RNA로 cDNA를 합성하여 cloning하는 기술은 분자 생물학 분야에서 유전자의 구조 해석 및 목적 단백질의 발현을 목적으로 자주 사용되는 중요한 기술이다.
cDNA library의 제작은 일반적으로 목적 Poly A⁺ RNA에 상보적인 이중 가닥의 cDNA를 합성하고 이를 박테리아 또는 바이러스 유래의 vector에 넣어 이를 박테리아, 진핵세포 등에 도입하여 cDNA를 증폭시킨다. 이후 in vitro transcription 또는 in vitro translation등의 실험을 진행하여 이러한 cDNA를 분석한다.
이 제품은 주로 동물 또는 식물의 Poly A⁺ RNA에서 이중 가닥의 cDNA를 합성하고 Kit에 첨부된 pAP3neo 등의 plasmid vector에 cloning 하여 cDNA library를 제작하는 제품이다. cDNA library 제작시 Gubler-Hoffman법을 이용한 linker-primer법을 사용하고 있어 유전자의 방향성을 유지하는 directional cloning이 가능하다는 점이 특징이다.

내용

PrimeScript RTase (200 U/㎕)	5 ㎕
RNase Inhibitor (40 U/㎕)	5 ㎕
Oligo (dT) 18 Anchor Primer (1 μg/㎕)^*1	10 ㎕
5×1st Strand Synthesis Buffer^*2	20 ㎕
1st Strand dNTP Mixture	6 ㎕
E. coli RNase H/ E. coli DNA Ligase Mixture	10 ㎕
E. coli DNA Polymerase I (20 U/㎕)	10 ㎕
2nd Strand dNTP Mixture^*2	23 ㎕
5×2nd Strand Synthesis Buffer^*2	150 ㎕
T4 DNA Polymerase (1 U/㎕)	20 ㎕
10×T4 DNA Ligase Buffer	20 ㎕
T4 DNA Ligase (350 U/㎕)	20 ㎕
EcoR I- Sma I Adaptor (0.4 μg/㎕)	18 ㎕
Not I Supplement	135 ㎕
Not I (50 U/㎕)	15 ㎕
tRNA (10 ㎍/㎕)	5 ㎕
Dr. GenTLE Precipitation Carrier^*3	60 ㎕
3 M Sodium Acetate (pH5.2)	1 ㎖
pAP3neo Predigested Vector (100 ng/㎕)^*4	5 ㎕
RNase-free H₂O	640 ㎕
Control RNA (1 μg/㎕)^*5	5 ㎕
T7 promotor primer (5 pmol/㎕)^*6	20 ㎕
T3 promotor primer (for pAP3neo) (5 pmol/㎕)^*6	20 ㎕
Spin Column	5 개

^*1Oligo (dT)₁₈Anchor Primer는 Not I, Xho I 제한효소 site를 포함하고 있다 (VIII. Appendix 참조).
Not I이 아닌 Xho I 으로 절단하면 EcoR I-Xho I fragment로 double strand cDNA을 만들 수 있으며 생성된 효소부분을 이용하여 vector (탈 인산화 된 vector 사용 불가)의 cDNA library 구축에 사용할 수 있다.
본 제품에는 Xho I 효소는 포함되어 있지 않다.
Adaptor ligation 후에 Xho I으로 절단을 하는 경우에는 VIII. Appendix 3. 주의사항을 참고한다.

^*2 PrimeScript™ Double Strand cDNA Synthesis Kit (Code 6111)에 포함된 제품과는 조성이 다르다.

^*3 Dr. GenTLE™ Precipitation Carrier (Code 9094)와 동일한 제품이다.

^*4 EcoR I, Not I 으로 절단된 상태이다.

^*5 본 Kit에 포함된 Control RNA는 SP6 promoter 영역 하류에 pBR322 유래의 tetracycline 내성 유전자를 포함한 약 1.4 kb 단편을 삽입한 plasmid pSPTet3를 주형으로 SP6 RNA Polymerase를 이용해 in vitro transcription으로 합성한 것이다.
본 kit에는 1 반응 분량 (5 μg)의 Control RNA가 포함된다.
또한, Control RNA는 30개의 A (adenine) 염기를 함유한 poly A⁺tail을 가진 약 1.4 kb의 poly A⁺ RNA로, 이를 주형으로 double strand cDNA를 합성하고 적당한 plasmid에 삽입 했을 때 double strand cDNA가 full-length라면 plasmid는 tetracycline 내성을 갖게 된다.

^*6 Insert 확인 및 sequencing에 사용 가능하다. 염기서열은 사용자 메뉴얼의 VIII. Appendix를 참조한다.

주의) 본 제품에는 형질전환에 필요한 대장균은 포함되어 있지 않다. 메틸화 DNA에 의한 형질전환 (electroporation법)이 가능한 E. coli HST08 Electro-Cells (Code 9028)등을 별도로 준비해야 한다.

보존

- Dr. GenTLE Precipitation Carrier, 3 M Sodium Acetate (pH5.2): 4℃
- 기타 구성품: -20℃

제품 원리

Kit 이외의 필요한 시약, 기구류

- 사용자 메뉴얼 참고

Keyword :

Reverse Transcription (Takara)

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