Capturem™을 사용한 빠르고 간편한 his-tagged protein 대용량 고순도 정제
Capturem™ His-tagged Purification Large Volume
- 분비형 단백질과 같이 발현양이 적은 단백질 정제에도 최적: 심플한 정제과정
- 대용량 샘플에서의 고농축 단백질 정제: 한번에 50 ㎖ ~ 500 ㎖ 이상까지
- 최단 시간 고순도 단백질 정제: 10~30분 완료
■ Introduction
재조합 단백질의 효과적인 정제방법을 세팅하는 것은 학교와 산업체 양쪽의 연구 단계에서 매우 중요하다. 또한 단백질의 구조나 기능을 연구할 때 protein fusion tag는 실험에 필요한 고순도 단백질 생산에 중대한 역할을 하고 있다. 이 중 polyhistidine tags (e.g. 6xhis tags)을 IMAC (immobilized metal affinity chromatography) column으로 정제하는 방법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 IMAC column은 실험 시간이 오래 걸려 그 과정에서 단백질이 protease에 분해될 위험이 있다. Capturem™ His-tagged Purification Kit는 차세대 membrane 기반의 정제 기법으로 콜드룸 없이 실온에서 빠르고 효과적으로 타겟 단백질을 정제하고 농축할 수 있다.
발현율이 낮고 세포 밖으로 분비되는 단백질은 대용량의 cell lysate 혹은 배양배지에서의 정제가 필요하기 때문에 다수의 연구자들이 실험에 어려움을 겪고 있다. 따라서 일반 scale의 Capturem™ (miniprep, maxiprep, 96well plate)외에도 대용량의
Capturem™ His-tagged Purification Large Volume (Code 635724) (일회용, bottle-top 형태; 한번에 최대 500 ㎖ 적용 가능)을 추천한다. Capturem™ His-tagged Purification Large Volume (그림 1)은 지름 33 mm의 bottle과 호환이 가능하고 (그림 1, 패널 A), 같이 제공되는 Bottle Thread Adaptor (그림 1, 패널 B/C)을 사용면 지름 45 mm의 bottle과 호환이 가능하다. 또한, 이 제품을 사용하면 효과적으로 정제된 단백질을 농축할 수 있으며 이를 50 ㎖ tube에 바로 elution할 수도 있다(그림 1, 패널 D).
그림 1. Capturem™ His-tagged Purification Large Volume 세팅. Capturem™ His-tagged Purification Large Volume은 지름 33 mm의 thread glass bottle에 직접 연결하는 것이 가능하다 (패널 A). 또한 같이 제공되는 Bottle Thread Adaptor (패널 B)를 사용하면 지름 45 mm의 thread glass bottle에 연결이 가능하고 (패널 C), 이를 50 ㎖ tube에 바로 elution하는 것 역시 가능하다 (패널 D).
아래의 그림에서 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 6xhis-GFPuv을 정제하는 간단한 protocol을 확인할 수 있다 (그림 2). 6xhis-GFPuv은 loading 과정에서 Capturem™의 membrane에 결합되며 (그림 2, 패널 B/C상단), 이후 연두색의 단백질이 elution 과정에서 완전히 방출되는 것을 확인할 수 있다 (그림 2. 패널 C하단/D).
그림 2. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume 사용. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 6xhis-GFPuv을 아래에 기술한 방법에 따라 정제하였다.
패널 A. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume을 지름 33 mm thread glass bottle에 연결.
패널 B. 과발현 된 6xhis-GFPuv가 들어 있는 clarified lysate를 Capturem™에 로딩.
패널 C. 샘플 로딩 및 wash 후 Capturem™ membrane이 GFP (Green Fluorescent Protein)로 인해 연두색이 되었고 (상단), 이후 6xhis-GFPuv을 elution하자 membrane의 색이 흰색으로 돌아옴 (하단).
패널 D. 6xhis-GFPuv를 50 ㎖ tube로 elution.
■ Result
대용량의 lysate로부터 고순도 단백질 정제
Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 100 ㎖의 clarified cell lysate로부터 27 ㎎의 his tagged GFPuv (6xhis-GFPuv)을 15 ㎖의 elution volume으로 정제하였다. 전체 실험 protocol은 15분 이내 마무리되었으며, cleared lysate, flowthrough, eluate를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 6xhis-GFPuv의 분자량인 ~29 kDa의 단백질이 효과적으로 정제되었음을 확인할 수 있었다 (그림 3).
그림 3. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume 사용한 6xhis-GFPuv 정제 결과. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 100 ㎖의 cleared cell lysate에서 6xhis-GFPuv를 정제하고, 이후 lysate, flowthrough, eluate를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. (단백질 정제부터 SDS-PAGE까지의 protocol은 아래의 Methods 항목을 참고)
최단시간 고순도 단백질 정제
Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 200 ㎖의 clarified cell lysate로부터 10 ㎎의 his tagged mcherry (6xHN-mCherry)을 9 ㎖의 elution volume으로 정제하였다. 전체 protocol은 10분 이내 완료되었고, 이후 crude lysate, cleared lysate, flowthrough, eluate를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 6xHN-mCherry의 분자량인 ~30 kDa의 단백질이 효과적으로 정제되었음을 확인할 수 있었다 (그림 4). 이 실험은 의도적으로 과량의 단백질을 로딩 했음에도 고순도의 단백질을 얻을 수 있었기에 고순도의 단백질이 Capturem™의 효율에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다.
그림 4. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume 사용한 6xHN-mCherry 정제 결과. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 6 g의 cell pellet으로 제조한 cleared cell lysate에서 6xHN-mCherry를 정제하고, 이후 crude lysate, cleared lysate, flowthrough, wash, eluat를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 단백질의 정제부터 SDS-PAGE까지의 protocol은 아래의 Methods 항목에 나와있다.
Active secreted protein을 위한 초간단 정제
Secreted protein의 정제는 배양 상등액으로부터 대용량 정제가 필요하다는 점과 western blot으로 측정이 불가능할 정도로 단백질의 농도가 낮다는 점등의 여러 어려움이 있다. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume을 사용하면 이러한 어려움을 극복할 수 있다. 아래에서는 30분 만에 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 1.2 ℓ의 clarified cell supernatant로부터 his tagged
Metridia luciferase (6xhis-MetLuc)을 7.5 ㎖의 elution volume으로 정제하였다 (그림 5).
그림 5. Secreted his-tagged Metridia luciferase 정제. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 1.2 ℓ의 clarified cell supernatant (HEK293 CMV-MetLuc stable cell line 유래)에서 his tagged
Metridia luciferase (6xhis-MetLuc)를 정제한 결과이다 (
패널 A). Capturem™ membrane은 50 ㎖의 xTractor Buffer로 equilibration 되었고 (
패널 B), 600 ㎖의 cell culture supernatant가 2번에 걸쳐 최종 1.2 ℓ 로딩되었다 (
패널 C). 이후 Capturem™ membrane은 75 ㎖의 Wash Buffer로 Wash하고 (
패널 D), 7.5 ㎖의 Elution Buffer로 elution 했다 (
패널 E). 일련의 protocol은 30분만에 완료되었다.
Cleared lysate, flowthrough, eluate의 SDS-PAGE 및 Western blot을 anti-MetLuc 항체와 anti-6xhis 항체로 테스트한 결과, Capturem™이 6xhis-MetLuc의 분자량인 ~24 kDa의 단백질을 효과적으로 정제했음을 확인할 수 있었다 (그림 6). 이렇게 저발현 단백질 역시 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 정제하면 고농도로 농축되어 Western blot에서 확인이 가능해진다. 정제된 6xhis-MetLuc은 단백질의 활성을 유지하고 있어 Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter Assay에도 적용이 가능하였다.
그림 6. Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume으로 정제된 secreted his-tagged Metridia luciferase의 Western blot 결과. Cleared lysate, flowthrough, eluate가 SDS-PAGE로 테스트된 후 PVDF membrane으로 Western blotting을 진행한 뒤 rabbit polyclonal anti-MetLuc antibody (
패널 A), mouse monoclonal anti-6xhis antibody (
패널 B)를 probe로 실험을 진행하였다. 단백질의 정제부터 SDS-PAGE, Western blotting 모두 아래의 Methods 항목에 따라 진행되었다.
■ Conclusions
Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume을 사용하면 대용량의 cell lysate로부터 고농도로 고순도의 단백질을 빠르고 간단하게 정제할 수 있다. 이 새로운 기술을 이용하면 과량의 샘플이 로딩된 경우에도 단백질을 고순도로 정제 가능하다. 또한 대용량의 세포 배양 상등액으로부터 secreted protein의 정제 및 농축에도 사용이 가능하다. 이런 특징을 바탕으로 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume을 사용하면 secreted protein 혹은 저발현 단백질을 30분만에 정제 및 농축하여 단백질의 특성을 연구하고 downstream application에 적용할 수 있다.
■ Methods
6xhis-GFPuv 실험에서는 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume과 vacuum system을 사용하였다. 샘플은 5 g cell pellet을 200 ㎖ xTractor Buffer로 추출한 뒤 filtration 하고 얻은 clarified lysate를 사용했다. 이후 Capturem™ membrane은 20 ㎖ xTractor Buffer로 equilibration 하고, 여기에 100 ㎖의 clarified lysate를 로딩하였다. 다음은 30 ㎖로 wash를 하고, Capturem™ membrane에 정제된 protein을 15 ㎖로 elution 하였다. 이때 사용한 wash buffer와 elution buffer는 사용자 매뉴얼 “Capturem His-Tagged Purification Large Volume Protocol-At-A-Glance”에 나온 내용대로 제작하였다. 정제 후 단백질 농도는 NanoDrop spectrophotometer로 측정하였으며 clarified lysate, flowthrough, eluate는 4~20% SDS-PAGE gel에서 확인하였다.
6xhis-mCherry 실험에서도 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume과 vaccum system을 사용하였다. 샘플은 6 g cell pellet을 200 ㎖ xTractor Buffer로 추출한 뒤 filteration 하고 얻은 clarified lysate를 사용하였다. 이후 Capturem™ membrane은 20 ㎖ xTractor Buffer로 equilibration 하고, 여기에 100 ㎖의 clarified lysate를 로딩하였다. 그후, 30 ㎖로 wash를 하고, Capturem™ membrane에 정제된 protein을 9 ㎖로 elution 하였다. 정제 후 단백질 농도는 NanoDrop spectrophotometer로 측정하였고 crude lysate, clarified lysate, flowthrough, eluate는 4~20% SDS-PAGE gel에서 확인하였다.
6xhis-MetLuc 실험에서도 Capturem™ His-Tagged Purification Large Volume과 vacuum system을 사용하였다. 샘플은 1.2 ℓ의 세포배양 상등액으로 HEK293 CMV-MetLuc stable cell line (35 x 15 ㎝ plate)에서 회수하여 원심분리기로 clarify하여 사용하였다. Capturem™ membrane은 50 ㎖ PBS로 equilibration 하였고, 여기에 모든 샘플을 50 ㎖/min의 속도로 로딩하였다. 다음은 75 ㎖로 wash를 하고, Capturem™ membrane에 정제된 protein을 7.5 ㎖로 elution 하였다. 정제 후 단백질 농도는 NanoDrop spectrophotometer로 측정하였고 clarified lysate, flowthrough, eluate는 4~20% SDS-PAGE gel에서 분석되고 이후 PVDF membrane으로 Western blotting을 진행했다. 같은 샘플로 두번 진행된 blot은 primary rabbit polyclonal anti-MetLuc antibody (1:500 dilution)와 primary mouse monoclonal anti-6xhis antibody (1:1,000 dilution)로 각각 확인하였고 이때 secondary antibody (1:5,000 dilution)를 같이 사용해 Femto Detection Reagent로 결과를 확인했다. 마지막으로 정제한 6xhis-MetLuc의 fluorescent 활성은 Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter Assay을 사용해 테스트하였다.
■ 관련제품
- His-tag 융합 단백질 정제 선택가이드
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