Efficient nonviral T-cell engineering: CRISPR takes a giant step towards the clinic

The promise of CRISPR for T-cell engineering
수년 동안 연구자들은 유전적으로 조작된 T 세포를 이용해 암 면역 치료법, 유전 질환의 교정, 병원체에 대한 내성 부여 등의 연구를 진행해왔다 (그림 1). CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집 기술의 발달로 T 세포 교정에 이를 적용할 수 있게 되었으나, dsDNA를 electroporation하여 전달하게 되면 무작위로 DNA 서열이 끼어들어가거나, 세포 독성을 유발할 수 있어 임상적으로 이 기술을 적용하는 것은 HDR (Homology-directed repair) template를 바이러스로 전달하는 것에 국한되어 있다.
Alexander Marson 교수 연구팀이 Nature 학술지에 출간한 획기적인 논문에 따르면, T 세포 교정에서 Cas9-sgRNA의 RNP (ribonucleoprotein) 복합체를 HDR template (dsDNA, ssDNA 형태)와 함께 electroporation하면 바이러스를 이용한 도입 없이도 세포 독성을 최소화할 수 있다고 보고한 바 있다. 이 방법을 이용해서 본 논문의 저자는 희귀한 단일 유전자 돌연변이 질환 (monogenic disorder)을 앓고 있는 자매로부터 T 세포를 획득하여 면역과 관련되어 있는 돌연변이를 성공적으로 교정하였으며, 이를 이용해 암 세포를 타겟 하는 in vitro, in vivo 모델을 제작했다.


그림 1. T 세포 기반 치료 과정

Overcoming the technical limitations
본 논문의 저자는 Cas9-gRNA로 인해 유발되는 double strand DNA breakage 부위와 반응하는homology-directed repair (HDR) DNA template를 이용하여, 목적 insert 서열이 특정 부위에 삽입되도록 하는 유전자 knock-in (KI) 방식을 확립하였다 (그림 2). 기존에는 dsDNA를 electroporation 방식으로 유도하면 세포 독성이 발생하기에, 바이러스를 이용해 T 세포를 재프로그래밍 해왔던 반면, Roth et al.,의 논문에 의해 Cas9-gRNA를 이용하는 RNP 방식을 HDR template와 함께 electroporation하면 이러한 세포 독성이 현저하게 낮아질 수 있다는 것이 확인되었다. 또한 HDR template 형태에 따른 성능을 비교했을 때, dsDNA보다 ssDNA를 이용한 실험에서 더 많은 용량에서도 더 높은 세포 생존능력을 보였을 뿐 아니라, off-target의 발생이나 삽입 오류도 현저히 낮음을 확인했다.



그림 2. T cell 교정 과정과 application
The method developed by Roth et al., 2018 involves electroporation of Cas9-gRNA RNPs in tandem with linear dsDNA or ssDNA, which provides a template for homology-directed repair (HDR) following site-specific Cas9-mediated cleavage. Bottom. The authors employed their method to insert fluorescent protein tags, to engineer single-nucleotide substitutions, and to replace entire gene sequences.

본 논문의 저자는 KI 성능을 확인하기 위해 다양한 loci에 형광 단백질 서열을 삽입하여 이를 증명하였으며, 이를 통해 50% 이상의 삽입 효율을 확인하였을 뿐 아니라 최대 3개의 loci에서 동시에 biallelic하게 삽입되었으며, 다중 유전자 삽입에도 성공하였음을 확인하였다 (표 1, 그림 3). 이후 새로 합성된 형광 단백질이 융합 단백질에 국소화, 기능, 발현 조절에 영향을 미치지 않았음에 대한 추가 분석 또한 진행되었다.

세포 유형	평균 Knock-in 효율	평균 세포 생존력
CD4 +	33.7 %	68.6 %
CD8 +	40.3 %

표 1. Rab11A locus에 삽입된 GFP의 확인 및 KI 후의 세포 생존 능력


그림 3. KI을 통해 Bialleic하거나 다중으로 삽입된 형광 단백질 확인

Making strides for clinical applications
본 논문 저자가 확인한 KI 방식의 치료 가능성을 입증하기 위해, 희귀한 단일 유전자 돌연변이 질환 (monogenic disorder)을 앓고 있는 3명의 자매로부터 T 세포를 획득하여 IL-2α 수용체 (IL2RA)를 발현하는 유전자의 두 allele 내 돌연변이를 교정하였다. HDR template와 결합한 RNP complex를 electroporation한 후, 상당수의 목적 세포 표면에서 IL-2α 발현이 회복되었을 뿐 아니라 후속 분석을 통해 IL-2α에서 매개되는 신호 전달 또한 확인되었다. 본 논문의 저자는 3명의 자매의 질병 치료를 목적으로 교정된 T 세포를 투여할 계획이라고 밝혔다.
병원성 돌연변이의 정확한 교정 외에도, 본 논문의 저자는 KI을 이용해 암 면역 치료제를 개발하는 연구를 진행하였다. NY-ESO-1 종양 항원을 인식하는 TCR이 발현되도록, 내인성 TCR-α 서열을 TCR-α/β로 대체하는 HDF template를 디자인하였다. NY-ECO-1+ 흑색종 세포를 타겟하도록 T 세포를 교정하였으며, 이 T 세포를 이용했을 때 In vitro 상에서 retrovirus를 이용한 것과 유사한 수준으로 강력한 T 세포의 활성과 암 세포가 제거된 결과를 얻었다. 연구자들은 Adoptive cell therapy에 필요한 적절한 양을 얻기 위해, 6명의 건강한 공여자로부터 수백만개의 T 세포를 electroporation하였다. 이후, 교정된 T 세포를 흑색종을 가지는 마우스 실험 모델에 투여함으로써 종양 부위를 국소화하고, 종양 증식을 억제함을 확인하였고, Lentivirus를 이용해 조작된 T 세포에 비교하더라도 KI으로 교정된 T 세포에서도 성능을 입증하였다.


그림 4. 암세포를 표적으로 하는 T 세포 항원 특이성의 reprogramming 과정
Using their method, the authors swapped in sequences encoding a TCR specific to the NY-ESO-1 antigen at the TCRa locus. The authors then demonstrated that the engineered T cells successfully targeted NY-ESO-1+ cancer cells in vitro and in a mouse model.

Looking forward
바이러스를 이용하지 않는 T 세포 reprogramming 방법을 개발함으로써, 본 논문의 저자들은 임상 적용에 더 적합한 솔루션을 고안했을 뿐 아니라, T 세포 교정에 요구되는 시간을 수개월 혹은 수년에서 몇 주로 단축함으로써 비용과 개발 속도를 가속화하고 치료제 개발 가능성을 확장했다. 이 과정에서 확인된 Cas9과 HDR template 비율, electroporation의 조건 최적화 등은 향후 수년동안 여러 연구에서 큰 도움이 될 것으로 기대된다.

Code	제품명	용량
632635	Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit	50 회
632641	Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)	100 ㎍
632666	Guide-it™ Long ssDNA Production System v2	50 회
631448	Guide-it™ Mutation Detection Kit	25 회
632659	Guide-it™ Knockin Screening Kit	100 회

[원문] Efficient nonviral T-cell engineering: CRISPR takes a giant step towards the clinic
[참고문헌]
- Roth, T.L et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat. Lett. 559, 405-409 (2018).