PCR、LA PCR™、Hot Start PCR에 대하여
PCR의 원리
PCR (Polymerase Chain Reaction) 법은
· DNA 가닥의 열변성 (denaturation step)
· 프라이머와 annealing (annealing step)
· Polymerase에 의한 DNA 합성 신장 (extension step)
을 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법이다(그림 1). 이 방법을 사용하면 DNA를 수시 간 내에 적어도 105배로 증폭시킬 수 있다. TaKaRa Taq (TaKaRa Code R001)은 Thermus aquaticus YT-1 주로부터 DNA polymerase 유전자를 클로닝하여 그 유전자를 도입한 재조합체 대장균을 이용해 대량 발현 하여, 고도로 정제한 94 kDa의 내열성 DNA polymerase로서 천연의 Taq DNA polymerase와 같은 기능을 갖고 있다.
· 프라이머와 annealing (annealing step)
· Polymerase에 의한 DNA 합성 신장 (extension step)
을 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법이다(그림 1). 이 방법을 사용하면 DNA를 수시 간 내에 적어도 105배로 증폭시킬 수 있다. TaKaRa Taq (TaKaRa Code R001)은 Thermus aquaticus YT-1 주로부터 DNA polymerase 유전자를 클로닝하여 그 유전자를 도입한 재조합체 대장균을 이용해 대량 발현 하여, 고도로 정제한 94 kDa의 내열성 DNA polymerase로서 천연의 Taq DNA polymerase와 같은 기능을 갖고 있다.
그림 1 PCR법에 의한 DNA 증폭 과정
Step 1 : 프라이머, dNTP, 내열성 DNA polymerase를 함유한 반응액 중에 목적 ds DNA 단편을 열변성한다(94℃, 30 sec).
Step 2 : 열변성에 의해 생긴 주형 ss DNA에 프라이머를 annealing한다 (55℃, 30 sec).
Step 3 : DNA polymerase를 이용하여 상보적 가닥의 DNA를 합성한다 (72℃, 1 min).
Step 4 : 증폭 산물인 ds DNA를 재열변성하여 ss DNA를 형성한다 (step 1로 되돌아 간다).
Step 1~4를 1 cycle로 하여 25~30 cycles을 반복한다. 단, 목적 DNA 단편에 따라 증폭의 최대 효율을 얻을 수 있는 조건이 다르므로 목적 DNA 단편에 따라 PCR 조건을 변경할 필요가 있다.
Step 2 : 열변성에 의해 생긴 주형 ss DNA에 프라이머를 annealing한다 (55℃, 30 sec).
Step 3 : DNA polymerase를 이용하여 상보적 가닥의 DNA를 합성한다 (72℃, 1 min).
Step 4 : 증폭 산물인 ds DNA를 재열변성하여 ss DNA를 형성한다 (step 1로 되돌아 간다).
Step 1~4를 1 cycle로 하여 25~30 cycles을 반복한다. 단, 목적 DNA 단편에 따라 증폭의 최대 효율을 얻을 수 있는 조건이 다르므로 목적 DNA 단편에 따라 PCR 조건을 변경할 필요가 있다.
1. 정확성(Fidelity)
Taq DNA polymerase는 일반적으로 정확성이 그다지 높지 않은 것으로 알려져, PCR 중의 misincorporation (mismatching)이 문제가 되는 경우가 있으므로 PCR 클로닝, 변이도입 등의 경우에는 주의가 필요 하다.
Taq DNA polymerase는 일반적으로 정확성이 그다지 높지 않은 것으로 알려져, PCR 중의 misincorporation (mismatching)이 문제가 되는 경우가 있으므로 PCR 클로닝, 변이도입 등의 경우에는 주의가 필요 하다.
2. 증폭단편의 길이
Taq DNA polymerase를 사용한 PCR은 통상 수 kb의 DNA를 증폭하나, 10 kb를 넘는 단편의 증폭은 어려운 것으로 알려져 있다. 이는 특히 mapping 등의 게놈 해석에 PCR법을 이용하는데 장애가 되어 왔다.
Taq DNA polymerase를 사용한 PCR은 통상 수 kb의 DNA를 증폭하나, 10 kb를 넘는 단편의 증폭은 어려운 것으로 알려져 있다. 이는 특히 mapping 등의 게놈 해석에 PCR법을 이용하는데 장애가 되어 왔다.
또 클로닝 등 PCR 이후의 실험이나 고감도를 요구하는 식품환경위생 검사 등에 있어서는 증폭량을 늘리는 것이 매우 중요하다.
TaKaRa에서는 이와 같은 한계를 극복하고자 polymerase/버퍼/반응조건을 종합적으로 검토한 결과 40kb의 DNA를 정확히 그리고 보다 많은 양으로 증폭할 수 있는 PCR 기술 (TaKaRa Ex Taq, TaKaRa LA Taq) 즉, LA PCR technology (LA=long and accurate)를 개발하였다. 이 LA PCR 기술은 PCR의 응용분야를 더욱 확대하는 것으로 게놈 해석, 유전자 진단, 긴 단편의 클로닝 그리고 변이도입 등에 폭넓게 이용되고 있다.
TaKaRa에서는 이와 같은 한계를 극복하고자 polymerase/버퍼/반응조건을 종합적으로 검토한 결과 40kb의 DNA를 정확히 그리고 보다 많은 양으로 증폭할 수 있는 PCR 기술 (TaKaRa Ex Taq, TaKaRa LA Taq) 즉, LA PCR technology (LA=long and accurate)를 개발하였다. 이 LA PCR 기술은 PCR의 응용분야를 더욱 확대하는 것으로 게놈 해석, 유전자 진단, 긴 단편의 클로닝 그리고 변이도입 등에 폭넓게 이용되고 있다.
LA PCRTM의 원리
LA PCR에 있어서 핵심이 되는 것은 효소이다. TaKaRa Ex Taq, TaKaRa LA Taq은 3’→ 5’ exonuclease 활성 (proofreading 활성)을 갖는 내열성 DNA polymerase이다. 잘못된 염기가 도입되면 그 이후의 반응성이 극단적으로 나빠지는데, 이를 3’→ 5’ exonuclease 활성에 의해 제거하여 반응을 순조롭게 진행시킴으로써 결과적으로 긴 단편의 DNA를 증폭할 수 있게 된다 (그림 2).
그림 2 LA PCR의 원리
1) Barnes, W. M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2216-2220.
2) Cheng, S. et al. ( 1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5695-5699.
3) Cheng, S., Highchi, R. and Stoneking, M. (1994) Nature Genet, 7, 350-351.
4) Cheng, S. et al. (1994) Nature, 369, 684-685.
5) Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988) Science, 239, 487-491.
6) Scharf, S. J., Horn, G. T. and Erlich, H. A. (1986) Science 233, 1076-1078.
7) Gyllensten, U. B. and Erlich, H. a. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7652-7656.
8) Kawasaki, E. S., Clark, S. C., Coyne, M. Y., Smith, S. D., Champlin, R., White, O. N.and McCormick, F. P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5698-5702. 9) Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Myambo, K. B., Drummomd, R. and Gelfand, D. H. (1988) J. Biol. Chem, 264, 6427-6437.
2) Cheng, S. et al. ( 1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5695-5699.
3) Cheng, S., Highchi, R. and Stoneking, M. (1994) Nature Genet, 7, 350-351.
4) Cheng, S. et al. (1994) Nature, 369, 684-685.
5) Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988) Science, 239, 487-491.
6) Scharf, S. J., Horn, G. T. and Erlich, H. A. (1986) Science 233, 1076-1078.
7) Gyllensten, U. B. and Erlich, H. a. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7652-7656.
8) Kawasaki, E. S., Clark, S. C., Coyne, M. Y., Smith, S. D., Champlin, R., White, O. N.and McCormick, F. P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5698-5702. 9) Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Myambo, K. B., Drummomd, R. and Gelfand, D. H. (1988) J. Biol. Chem, 264, 6427-6437.
Hot Start PCR
Hot Start PCR은 PCR의 첫번째 cycle에서의 mispriming이나 primer dimer 유래의 비특이적 증폭을 방지하고, 목적 단편의 증폭효율을 높이는데 효과적이다. TaKaRa Taq (Hot Start Version), TaKaRa Ex Taq (HotStart Version), TaKaRa LA Taq (Hot Start Version) 은 anti-Taq 항체와 결합시킨 Hot Start용의 PCR 효소로 최초의 열변성 (step 1)에서 항체가 변성되어 효소로 부터 분리될 때까지 polymerase 활성이 억제된다.
그림 3 Hot Start PCR의 원리