SMART법을 이용한 cDNA 합성의 개요
SMART법 개요
SMART (Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template) 기술은 1st strand cDNA 합성 과정에서 cDNA 양 말단에 특정 서열을 삽입하는 획기적인 cDNA 합성기술이다. 별도의 Adaptor ligation 과정을 거치지 않고 양 말단에 특정한 서열을 삽입할 수 있으므로 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), cDNA library 제작, NGS (Next Generation Sequencing) 등의 다양한 실험에 적용이 가능하다. 이와 더불어, SMART법은 One-step으로 double strand cDNA까지 제작할 수 있어, 간편하게 매우 높은 감도로 Full length cDNA를 합성한다.
SMART법의 원리
SMART법은 SMART Moloney Murine Leukemia Virus에서 유래한 역전사효소 (MMLV RTase)가 보유한 아래의 2가지의 활성을 이용하여 Full length cDNA를 합성한다
- 말단전이활성 (Terminal transferase activity)
MMLV RTase가 mRNA template의 5’ 말단에 이르렀을 때, cDNA의 3’ 말단에 일부 뉴클레오타이드를 부가하는 능력
- 주형전환활성 (Template switching activity)
새로운 주형(template)으로 바꾸어 DNA를 합성하는 활성
모든 SMART와 SMARTer제품에는 다카라바이오가 독자적으로 개발한 특정 서열을 가진 Modified oligo dT primer를 이용하여 1st strand cDNA를 합성한다 (그림 1 왼쪽). SMARTScribe MMLV RTase가 mRNA의 5’ 말단에 이르면 말단전이활성 (Terminal transferase)에 의하여 새로 합성한 cDNA의 3’ 말단부위에 새로운 뉴클레오타이드를 부가한다. 이렇게 부가된 뉴클레오타이드에 SMART(er) Oligo가 결합하며, SMARTScribe MMLV RTase의 주형전환활성 (Template switching)에 의해 SMART(er) Oligo의 말단까지 cDNA 합성을 연장한다.
SMART법을 이용하면 Modified oligo dT primer와 SMARTer Oligo를 사용하여 1st strand cDNA 합성 과정에서 adaptor와 같은 특정 서열을 부가시킬 수 있기 때문에, PCR 증폭, RACE, NGS Library 구축 등 다양한 실험법에 적용 가능하다.
그림 1. SMART법의 원리와 기존의 cDNA 합성 방법과의 비교 SMART(er) cDNA 합성은 Enzyme cocktail 처리와 여러 스텝이 필요한 기존의 cDNA 합성법과 비교하여 단 하나의 튜브에서 한번의 cDNA 합성 반응으로 1st strand cDNA 합성을 완료할 수 있다. 특히, cDNA 합성 이후 별도의 adaptor ligation 과정 또는 정제 과정 없이 Adaptor를 부가시킬 수 있으므로 PCR, NGS, cDNA library, RACE 등 여러 가지 실험에 접목 가능하다.
SMART(er) 키트의 업그레이드
독자적으로 개발한 SMARTScribe MMLV RTase와 SMART(er) Oligo를 접목하고 반응조건을 개량하여 업그레이드 버전의 SMARTer 제품을 개발하였다. SMARTer 제품은 보다 더 효율적으로 cDNA를 합성할 수 있으며, 미량의 샘플에서도 Full length cDNA를 합성할 수 있다.
고품질의 Full length cDNA 합성
cDNA 합성은 RNA template의 구조에 의하여 저해를 받기 쉽기 때문에 기존의 cDNA 합성법의 경우 RNA template의 5’ 말단까지 도달하지 못 하고, cDNA 합성이 끊어져 Full length cDNA를 얻기 어렵다. 이에 비하여 SMART/SMARTer 법의 경우 RNA template의 5’ 말단에서 말단전이활성과 주형전환활성을 이용하기 때문에, 5’ 말단에 도달하지 못 한 1st strand cDNA는 PCR 증폭과정에서 증폭될 수 없다. 그러므로 SMART법은 온전한 길이의 Full length cDNA를 얻을 수 있는 효율적인 방법이다.
최소의 RNA 시료를 이용한 1-tube, 1-step 반응
SMART 실험법은 하나의 튜브에서 한번의 효소 반응으로 cDNA를 합성하므로, 샘플의 손실이 아주 적고 RNA가 분해될 위험성을 최소화한다. 또한, adaptor ligation, tailing, 정제 과정 등이 필요 없어 매우 간단한 실험 방법으로 사용이 가능한 방법이다.
매우 높은 감도와 효율의 cDNA 합성법
SMART법의 또 하나의 장점은 Adaptor 서열을 ligation으로 부가하는 일반적인 방법에 비하여, adaptor 서열을 부가하는 효율이 매우 높다는 것이다. 그러므로, LCM (Laser capture cell), microdissected tissue, biopsy samples와 같은 아주 적은 RNA양을 가진 샘플에서 SMART법은 매우 유용하게 사용될 수 있다.
다양한 SMARTer 제품과 적용
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