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Home > 전제품보기 > Inducible System · Yeast hybrid > [개요] Yeast Hybrid System > [개요] Matchmaker Gold Yeast Hybrid System

[개요] Matchmaker Gold Yeast Hybrid System

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상호작용하는 새로운 단백질의 확인
Clontech의 Matchmaker Gold System은 새로운 Protein-protein, Protein-DNA 상호작용을 확인하고 그 기능을 파악하기 위한 한층 더 진보된 기술이다. Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System은 yeast에 민감한 Aureobasidin A (AbA) 항생제 내성 (Ab A resistence repoter)과 두 개의 영양 리포터 (nutritional reporter), blue/white 선별을 이용한 4 개의 reportersystem으로 구성되어 있어 가장 낮은 background와 간단하지만 엄격한screening을 할 수 있다. (Figure 1).
Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System의 경우도 protein-DNA 상호작용을 screening 하기위하여 AbA 내성을 이용한다.

고품질의 full-length cDNA를 증가시키는 SMART 기술
일반적인 방법으로 cDNA를 합성하면 template RNA가 2차 구조를 형성하여 cDNA합성을 방해하는 경우가 있어 유전자의 5、-말단이 일반적으로 불충분하게 합성된다. 진핵세포의 5、-말단에서의 terminal transferase activity와 이어지는 SMART switching 과정 때문에 역전사 반응 시 말단까지 진행되지 못한 불완전 1st strand cDNA는 SMART(er) oligonucleotide와 결합하지 못하고 PCR반응 단계에서는 증폭되지 못한다. 그러므로 SMART 기술로 만들어지고 긴 단편 증폭용 PCR에 의해 증폭된 cDNA는 풍부한 fulllength cDNA를 합성한다. 5、-SMART(er) 서열과 변형된 oligo dT primer에는 genomic DNA나 ribosomal RNA에서 전사된 cDNA가 결합하지 못하기때문에 SMART를 이용하여 만들어진 cDNA는 genomic DNA나 rRNA유래 cDNA의 오염을 걱정하지 않아도 된다.

GAL4 기반의 Yeast Two-Hybrid System
Yeast two-hybrid system은 yeast GAL4 전사인자의 조절 특성을 이용하는 시스템으로 GAL4 전사인자는 서열 특이적인 DNA bining domain (DNA-BD)과 transcription activation domain (AD)으로 구성되어 있다. Matchmaker시스템에서는 목적 단백질을 DNA-BD와 융합하여 "bait" 단백질을 만들며,목적 단백질과 상호작용할 것으로 생각되는 미지의 단백질 (cDNA library 형태)은 GAL4-AD와 융합 (fusion)하여 "prey" 단백질로 발현된다. 이들 두 bait와 prey 융합 단백질이 yeast에서 발현되어 상호작용할 때만 reporter gene의 전사를 활성화시킬 수 있다.

4 개의 Reporter로 강력하고 엄격한 Screening
Matchmaker Gold System은 yeast (S. cerevisiae)가 아주 강한 항생제인AbA에 대한 내성을 reporter로 사용하는 유일한 시스템이다. Bait-prey가 상호작용하면 AUR1-C reporter gene이 활성화되어 AbA 존재하에서도 yeast가 생존할 수 있게 되며, AUR1-C 를 발현시키지 못하는 yeast는 죽게 되므로 background colony의 생존을 막을 수 있다. Matchmaker Gold의 높은 정확성은 3 개의 다른 GAL4-responsive promoter에 의하여 조절되는 4 개의 selectable reporter gene을 가지고 있는 Y2HGold reporter strain에 의해 가능하다. 이러한 reporter의 전략적 조합을 통하여 거짓으로 GAL4 promoter에 결합하는 prey protein에 의해 나타나는 false positive colony 제거할 수 있으며, 통상 false positive clone은 상호작용에 의한 전사조절이라기 보다는 3 개 중 하나의 GAL4 promoter에 직접 prey 단백질이 단독으로 결합하여 생성되는 경우가 많다.

Mate & Plate Library로 간편화한 Screening
Clontech은 번거로운 library 조작과 대규모의 yeast transforamtion을 대체할 수 있는 간단하고 쉬운 "Mate & Plate" Library를 판매하고 있다. Mate & Plate 기술은 각각 bait 또는 prey 융합단백질을 발현하고 있는 서로 상반되는 mating type의 두 haploid yeast strain을 mating 시키고 mating strain을 선택 배지 상에 도말하는 것으로 구성되어 있다. Y2HGold bait reporterstrain (MATα mating type)은 pGBKT7-bait plasdmid로 형질 전환시켜 만들 수 있다. Mate & Plate library는 Y187 MATα에 cDNA library를 미리 transforamtion시켜 prey 단백질을 발현하고 있어, Y2HGold의 mating 파트너로 적합하다. 자신만의 library를 직접 제작하고자 한다면 Clontech의 편리한 Make Your Own "Mate & Plate" Library System을 사용하면 된다.

다양한 도구와 시스템
Matchmaker 단백질 분석 기술은 protein-protein 또는 protein-DNA간 상호작용의 연구를 위한 완벽한 제품 라인을 제공한다. Yeast에서 확인된 상호작용을 한 번 더 확인하기 위해서는 Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit와 포유류 two-hybrid 분석을 위한 Matchmaker Mammalian Assay Kit 2를 포함한 다양한 부가적인 방법과 기술을 사용할 수 있다.

Figure 1. Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System design. Libraryderived,transcription-activating prey fusion proteins that interact with the DNA-binding bait fusion protein activate the expression of reporter genes.