RetroNectin^® (Code T100A/B, T201)의 co-stimulation을 이용한 T-lymphocytes (T-cells, CAR-T Cell) 확대 배양

RetroNectin은 Lenti/Retrovirus vector를 포유류 세포에 도입하는 ”유전자 도입” 효율을 증가시키기 위한 목적으로 널리 활용되고 있으며, 또한 T-cell의 확대배양에도 효과가
있는 것으로 확인되었다.

일반적으로 T-cell 확대배양은 anti-CD3 antibody 및 Interleukin-2 (IL-2)를 첨가하여 실시한다. 이 때, RetroNectin을 추가하면 기존 방법 대비 확대배양 효율을 크게 증가시킬 수 있다. 이러한 방법으로 확대배양된 T-cell 집단에는 미분화 세포인 Naive T-cell의 비율이 높으며, 이것은 Antigen-presenting cell (APC)에 의해 세포독성 T-cell (Cytotoxic T-cell)로 분화하는
능력을 가진다.

※ RetroNectin을 이용한 lymphocyte 확대배양을 연구 이외의 목적으로 실시하는 경우에는 다카라바이오와 별도의 라이센스 계약을 체결해야 합니다.

가스 투과성 culture bag을 이용한 배양 시스템에서 RetroNectin의 co-stimulation을 이용한 T-cell 확대 배양

[Culture Schedule과 방법]



첫째날 (Day 0)

Step 1) CultiLife™ 215 Culture bag (Code FU0005)에 Anti-CD3 mAb GMP grade (Code T210)와 RetroNectin을 코팅 (Day 0)
- Anti-CD3 항체 (OKT3) (5 ㎍/㎖)와 RetroNectin (25 ㎍/㎖)이 포함된 PBS solution 30 ㎖를 CultiLife 215 Culture bag (Code FU0005)에 전량 첨가한다.
※ OKT3과 RetroNectin의 코팅에는 CultiLife™ 215을 사용하며, GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag (Code FU0010)은 코팅 목적으로 사용할 수 없다.
- 37℃, CO₂조건하에서 2 ~ 5 시간 동안 코팅 후 Culture bag 안의 용액을 전량 제거한다.
- PBS 30 ㎖를 이용하여 culture bag을 세 번 세척한다. (마지막 PBS는 세포 첨가 직전에 제거한다.)

Step 2) Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 첨가
- PBMCs 3 × 10⁷ cells를 0.5~5 %의 혈청 또는 혈장이 포함된 GT-T551 Culture medium (Code WK551S) 30~50 ㎖에 현탁한다.
※ GT-T551 media를 사용하는 경우, 일반적으로 0.5~1 %의 혈청 또는 혈장을 첨가한다.
- PBMCs 현탁액에 IL-2를 첨가한다 (최종 배양액에 200 ~ 1,000 U/㎖ 농도로 첨가).
- Step (1)의 RetroNectin과 anti-CD3를 코팅한 CultiLife™ 215에 IL-2이 포함된 PBMCs 현탁액을 전량 첨가한다.
- 최종 volume이 200~300 ㎖이 되도록 Culture bag에 media를 첨가한다.
- 37℃, 5% CO₂에서 배양한다.



Step 3) Passage (Day 4)
- CultiLife™ 215의 세포의 일부 또는 전량을 GT-T610 (CultiLife™ Eva)로 옮긴다
※ 배양된 PBMCs는 RetroNectin에 의해 culture bag에 강하게 결합되어 있으므로, 아래의 그림과 같이 양손으로 앞, 뒤 약 50회 흔들어 세포를 culture bag에서 분리시킬 수 있다.



※ CultiLife™ 215 culture bag에서 세포가 분리되었는지 현미경으로 확인할 수 있다.
- 적정량의 IL-2 (200 ~ 1,000 U/㎖)가 포함된 배지를 첨가한다.
※ GT-T610 (CultiLife™ Eva) bag의 최대 volume은 1,000 ㎖이다.
- 37℃, 5% CO₂에서 배양한다.
- 세포 증식에 따라 적절히 배지를 첨가, passage하면서 GT-T610 (CultiLife™ Eva)의 수를 늘려 10~14일간 배양한다.

Step 4) Harvest (Day 10~14)
- GT-T610 (CultiLife™ Eva)에서 확대 배양된 PBMCs 세포를 centrifuge 등의 방법으로 회수한다.



※참고 자료

	Day 0	Day 4	Day 7	Day 10
PBMCs number	3 x 107 cells
Culture volume	300 ㎖	500 ㎖ x 5*3	1,000 ㎖ x 5*4
Culture area	215 cm2*1	640 cm2*2 x 5
	CultiLife 215 x 1	GT-T610(CultiLife Eva) x 5		Harvest

^*1 CultiLife™ 215의 배양 면적은 215 ㎝² 입니다.
^*2 GT-T610의 배양 면적은 640 ㎝² 입니다.
^*3 Day4의 세포 농도가 4 × 10⁵ cells/㎖ 미만일 때, Day 5에 passage합니다.
   Day4에 세포 농도가 적어도 5 × 10⁴ cells/㎖ 이상일 때 passage합니다.
^*4 이때는 세포 농도가 5 × 10⁵ cells/㎖ 이상일 때 passage합니다.

[건강한 사람의 PBMCs 확대 배양 예]

<실험 방법>

실험 동의를 얻은 건강한 두 기증자의 혈액 50 ㎖로부터 PMBC와 혈장 (plasma)를 분리했다. RetroNectin (RN)으로 co-stimulation을 이용한 T-cell 확대배양의 효과를 확인하기 위해
설명된 방법으로 실험을 진행하였고, 0.6% Heat-inactivated plasma를 포함한 GT-T551 culture media를 Day 0과 Day 4에 사용하였다.



<결과>

Anti-CD3 항체만 사용한 것과 RetroNectin과 anti-CD3를 동시에 사용한 것을 비교하면, RetroNectin을 동시에 사용하여 배양한 PBMCs가 1.5배 이상 확대 배양되었으며,
Naive T-cell의 분포도 높은 것을 확인 할 수 있었다.

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Code	제품명	Size
T100A	RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)	0.5 mg (0.5 ml)
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T201	RetroNectin® GMP grade	2.5 mg
FU0005	CultiLife™ 215 Culture bag	10 pcs
FU0010	GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag	10 pcs
WK551S	GT-T551 Culture medium, 1L Bottle	1,000 ml
T210	Anti-CD3 mAb GMP grade	1.0 mg/1.0 ml