Q1. Agarose gel 전기 영동시 어떤 buffer를 사용하는 것이 좋은가요?
1,000 bp 이하이고, DNA 회수율이 크게 문제가 되지 않는 경우는 1 × TBE Buffer를 권장합니다. TBE buffer로 제작한 gel이 TAE buffer로 제작한 gel에 비해
선명한 밴드를 관찰할 수 있고, 크기가 비슷한 DNA 밴드를 확인하는 경우에는 TBE Buffer를 사용하면 보다 명확한 분리가 가능합니다.
15,000 bp 이상의 DNA는 1 × TAE Buffer를 이용하면 DNA 분리가 촉진되어 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 단, TAE Buffer는 TBE Buffer보다 완충력이 낮기 때문에
장시간 영동시에는 버퍼를 순환시키거나 음극 측과 양극 측의 버퍼를 혼합하는 작업이 필요할 수도 있고, 버퍼 완충력의 저하 속도는
전압/시간 (volts/hour)과 탱크의 용량에 따라 다릅니다.
Buffer는 gel 위로 3~8 mm 높이로 채워주며, 적은 양의 buffer를 사용하면 gel이 건조해지고, 과량의 buffer는 전기영동장치의 음극과 양극 사이의
저항을 낮추어,
그 결과 gel을 통과하는 전압이 낮아져 DNA의 이동 속도가 느려지거나, 과열 및 DNA 밴드의 변형을 일으킬 수 있습니다.
[참고- TAE, TBE buffer의 특징]
Buffer |
TAE buffer |
TBE buffer |
사용추천 |
· DNA 회수 실험에 적합
· 12 kb 이상의 큰 사이즈 DNA 전기영동에 최적
· 낮은 이온 강도와 buffering capacity
: 장시간 전기영동 시 필요에 따라 buffer 교체 |
· 작은 사이즈의 DNA 전기영동에 최적 (<1 kb)
· 높은 이온 강도와 buffering capacity
: 장시간 전기영동시 적합
· DNA의 이동성을 감소될 수 있음 |
* Lonza_BenchGuides_SourceBook 자료 발췌
Q2. 전기영동 중에 gel을 보면, loading dye가 활 모양으로 전기영동 되는 경우가 있는데, 왜 그런 것일까요?
높은 전압에서 전기 영동을 하면 gel 전체 온도가 균일하지 않아 젤 가장자리와 중앙의 온도가 달라져 loading dye가 활 모양으로 전기 영동되는 현상이 발생합니다.
gel 전체를 냉각하거나 전압을 낮추어 전기영동 하면 이런 현상을 개선할 수 있습니다.
Q3. MetaPhor Agarose를 사용할 때 주의 사항은 무엇인가요?
MetaPhor Agarose (Code 50180)은 고도의 분리능력을 가진 agarose로 2~4% MetaPhor agarose gel은 4~8% polyacrylamide gel 상당의 해상도를 나타내므로, AMPFLPs,
STRs 분석 등에 사용할 수 있습니다. MetaPhor agarose를 이용하는 경우, gel을 용해하여 실온에서 굳힌 후 (30 분), 4 ℃에서 30 분 냉장보관 후 전기 영동을 수행하면
분리능을 향상시킬 수 있습니다.
Q4. 전기영동 후 gel 염색에 사용하는 시약은 어떤 것이 있나요?
Ethidium bromide (EtBr)는 일반적인 UV illuminator로 관찰할 수 있고 저렴하기 때문에 널리 사용되고 있습니다. SYBR® Green I (Code 50512)은 dsDNA,
SYBR® Green II (Code 50522)는 RNA와 single strand DNA, GelStar (Code 50535)는 single, double strand에 모두 적용할 수 있습니다.
(경우에 따라 전용필터와 광원이 필요한 경우가 있으니, 각 제품페이지를 참고바랍니다). 염색 감도는 Ethidium bromide < SYBR® Green I < GelStar®
(각 형광 파장대에서 관찰시)입니다. 단파장 영역의 UV는 DNA 손상이 크기 때문에, 정제 후 cloning을 하고자 할 때에는, 장파장 영역의 광원을 가진 illuminator를 사용하는 것이 좋습니다.
Q5. Agarose gel을 염색 할 때 pre-staining과 post-staining에는 어떤 차이가 있나요?
전기영동 후 염색(post-staining)하면 균일하게 염색할 수 있어 선명하고 균일한 band를 확인 할 수 있습니다. 또한 염색시약을 여러 번 사용할 수 있기 때문에 gel 수가 많은 경우에는 적은 양의 염색시약를 사용하여 gel 염색을 할 수 있습니다. Gel에 직접 염색시약를 넣는 경우(Pre-staining)에는 gel을 만들 때 염색시약을 함께 넣어야 하기 때문에 균일한 염색이 어려운 단점이 있지만, 염색 시간을 단축할 수 있습니다.
SYBR® Green을 미리 첨가한 gel을 이용한 경우, 전기 영동 후 염색하는 방법에 비해 감도가 저하됩니다. 또한 DNA의 이동속도가 다르기 때문에 SYBR® Green 사용시 pre-staining 방법으로 염색하는 것은 권장하지 않습니다. GelStar®를 미리 넣은 gel을 사용한 경우, DNA의 이동속도는 GetStar®를 넣지 않은 gel보다 전기영동이 천천히 진행됩니다.
Q6. GelStar®로 염색한 DNA를 제한효소 처리, cloning 등 후속실험에 사용할 있나요?
GelStar로 염색한 DNA는 ligation, 제한 효소 반응 등과 같은 효소 반응을 저해하지 않습니다. 따라서 subcloning에 응용시 GelStar를 제거할 필요는
없고, 또한 in gel ligation 및
in gel digestion도 진행할 수 있습니다.
필요에 따라 에탄올 침전법(ethanol precipitation)을 통해서 핵산과 결합한 GelStar를 제거한 후 사용할 수도 있습니다.
