Real Time PCR은 PCR 증폭 산물을 실시간으로 모니터링하는 방법으로, 기존의 PCR법으로는 측정이 불가능했던 정확한 정량이 가능하다.
또한, PCR법을 기본으로 하고 있기 때문에 검출 감도가 높으며, 정성 분석뿐만 아니라 유전자 발현 분석 외에 SNP 타이핑, 바이러스나 병원균의 검출, 도입 유전자의 카피 수 해석, 유전자조작 식품(GMO)의 검사 등과 같이 다양한 정량 분석에도 널리 활용되고 있다. Real Time PCR은 반응 후에 증폭 산물을 전기영동으로 확인할 필요가 없어, 간편하고 신속하게 결과를 얻을 수 있고, 오염의 위험이 낮기 때문에, 최근에는 기존의 PCR법으로 검출하던 유전자 검사를 Real Time PCR로 검출하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.


Real Time PCR은 형광을 이용하여 PCR 증폭산물을 정량적으로 검출하며, 대표적인 형광검출방법은 intercalator를 이용하는 방법과 probe를 이용하는 방법으로 나눌 수 있다.
본 페이지에서는 가장 널리 사용되는 Probe 방법인 Dual-Labeled Probe를 이용한 Real Time PCR 시약을 소개하고자 한다.

Dual-Labeled Probe를 이용한 Real Time PCR 반응에는 한 세트의 primer와 하나의 Dual-Labeled Probe를 사용한다. Probe의 5’ end 에는 검출할 형광물질(F)이, 3’ end에는 형광을 발하지 못하도록 제어하는 quencher(Q)가 tag되어 있어, Probe가 annealing 단계에서 타겟 유전자에 특이적으로 hybridization 되어도 3’ end에 있는 quencher에 의해 형광을 내지 못한다. 이후 Extension 단계에서 Taq DNA Polymerase의 5’→3’ exonuclease 활성에 의해 주형에 결합된 probe가 분해되며 형광물질이 quencher로부터 분리, 형광을 발할 수 있게 된다. 이때 발하는 형광량을 측정하여 타겟 유전자의 증폭량을 측정할 수 있다.
Dual-Labeled Probe 외에 Cycling Probe 방법, Molecular Beacon Probe 방법 등도 있다.




Probe qPCR Mix, with UNG (Code RR392A/B)
Probe qPCR Mix (Code RR391A/B)

• 내열성 RNaseH (Tli RNase H) 로 잔존 mRNA도 제거하는 똑똑한 2 x premix
• 업그레이드 buffer 조성으로 일반 샘플은 물론, PCR 저해물질이 포함된 특이샘플에서도 탁월한 반응성으로 효율적인 증폭 실현

[다양한 샘플에 대한 적용성이 높은 Probe qPCR Mix]
PCR 반응의 저해제로 알려진 hematin (혈액 성분), humic acid (토양 성분), melanin (피부, 모발 성분), tannic acid (식물 성분) 등이 포함된 DNA 샘플과 포함되지 않은 DNA 샘플을 증폭한 후 Ct값을 비교하였다.
타사 동등 시약에 비해 PCR 억제물질이 포함된 샘플에서도 양호한 결과를 확인할 수 있었다.




역전사 반응 후 그대로 PCR 반응을 진행하면 잔존하는 mRNA가 cDNA와 결합하여 primer annealing을 방해하고 그로 인해 PCR 증폭효율이 저하될 수 있다.
역전사 반응 후 추가로 RNase H를 처리하여 잔존하는 mRNA를 분해하기도 하는데 이는 많은 실험과정 및 시간이 소요되고, 효소 처리/불활성화를 위한 번거로운 과정이 필요한 단점이 있다.
반면, Takara의 Real Time PCR용 premix 제품군에는 내열성 Tli RNase H가 포함되어 있어, 별도의 RNase H 처리과정을 추가할 필요가 없다. Premix 내에 포함된 Tli RNase H가 역전사반응 후 주형 cDNA 중에 남아있는 mRNA를 분해하여 잔존 mRNA에 의한 PCR 반응 저해 없이 높은 증폭효율로 정확한 Real Time PCR 정량 결과를 얻을 수 있다.




One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, with UNG (Code RR601A/B)
One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix (Code RR600A/B)

• 편리한 1 solution 1 step qRT-PCR kit (2 x premix)
• Multiplex qRT-PCR에 최적
• Crossover contamination 방지를 위한 UNG 포함 제품 라인업

[다양한 샘플에 대한 적용성이 높은 1 step Probe qPCR Mix]
Blood, tissue 등 다양한 샘플에 다량 존재하는 hematin, heparin, melanin, humic acid, tannic acid, 총 다섯 종류의 PCR 반응 저해물질을 반응액에 첨가하여 1 step Real Time RT-PCR을 진행하였다.
One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, Takara 기존 제품 및 타사 제품의 Ct값을 비교한 결과, One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix는 "첨가 없음"과 반응 억제물질 첨가 시의 Ct값의 차이가 적은 것으로 나타나, 각종 반응 저해물질에 대해 영향을 거의 받지 않았다.




PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix (Code RR650A/B)
PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix, with UNG (Code RR651A/B)

• 생체시료 (혈액, 소변 등) 로부터 RNA 정제없이 direct Real Time RT-PCR
• 2 x premix 하나로 핵산 열추출, 역전사 반응, Real Time PCR까지 연속으로 실시

[PCR 저해물질에 대한 최고 수준의 내성 - 생체시료의 direct qRT-PCR에 최적]
Hematin, heparin (혈액 성분), melanin (피부, 모발 성분), humic acid (토양 성분), tannic acid (식물 성분) 등 PCR 반응의 저해물질로 알려진 성분이 포함된 샘플에서도 효율적인 타겟증폭을 확인하였다.



2) Urine 샘플의 Zika virus 검출 예
Heparin blood 및 10배 희석 샘플에 황색 포도상구균 (S. aureus) 배양 희석액을 농도별로 첨가 후 16S rRNA를 검출한 결과, 약 100 cfu의 황색 포도상구균도 검출할 수 있었다.
※ N.D. : 검출되지 않음.
* 50 ㎕ 반응 기준 / ** 25 ㎕ 반응 기준
비활성화된 Zika virus를 Urine에 첨가 후, RNA 정제없이 PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix 로 Zika virus를 검출하였다. 그 결과, 별도의 RNA 정제없이 urine이 존재하는 샘플에서도 PCR 증폭효율 저하 없이 control (urine이 포함되지 않은 virus solution) 샘플의 수준 만큼 Zika virus를 효과적으로 검출할 수 있었다. (2,000 copy~2copy)



Dual-Labeled Probe 검출용 Real Time PCR 제품