Gene editing for cancer therapy/drug discovery
CRISPR/Cas9 gene editing 기술은 다양한 생명체의 유전자를 편집할 수 있는 강력한 도구로 사용되고 있다. 원래 미생물의 적응면역 시스템으로부터 발견되었는데, 이를 개선하여 현재는
특정 유전자를 발현하게 하거나 발현을 억제하기 위한 유전자 편집에 널리 사용되고 있다. 게다가, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술은 종양 생성의 과정이나 신약 후보 물질의 확인, 세포 치료제 개발에
활용되는 등 다양한 분야의 Cancer Research에 활용되고 있다 (Moses
et al. 2018).
Highlighted products - Cancer therapy
유전자 편집 기술은 목적 유전자의 특정 서열을 이용하는 종양 특이적 치료제 개발에 무궁무진하게 활용될 수 있다. 인유두종바이러스 (human papillomavirus, HPV) 유전자인
E6, E7은
규칙적인 세포 주기와 종양 억제 기능을 방해함으로써, 세포 사멸을 유도한다. Lao
et al.는 Cas9으로 편집된 HPV
E7 종양 유전자는
in vivo와
in vitro
모두에서 HPV로부터 유도되는 종양 활성을 억제하는 것을 확인하였으며, 그 과정에서 유전자 편집 효율을 확인하기 위해 다카라바이오의
Guide-it™ Mutation Detection Kit와
Guide-it™ Indel Identification Kit를 사용하였다.
유전자 편집 기술은 종양의 면역 파괴 능력을 무력화시킴으로써, 면역 치료제에도 활용될 수 있음을 보여주었다. Cas9-sgRNA RNP (ribonucleoprotein) 복합체를 이용하여 유전자를 T 세포에 삽입함으로써,
종양을 타겟하고 파괴할 수 있는 CAR (chimeric antigen receptor)-T 세포로 개량하였다. Kagoya
et al.은
Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit와
Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)를 사용하여 제작한 RNP complex를 electroporation을 이용해 세포 내로 도입함으로써, 최대 30% 효율로 TCR을 제거한 CAR-T 세포를 제작할 수 있었다.
이를 통해 histone H3-lysine 79 methyltransferase인
DOT1L을 억제하는 것이 동종 이계 T 세포 반응을 완화할 수 있다는 것을 확인하였다.
최근 Nature에 발표된 Alexander Marson 교수팀의 획기적인 연구에서는 Cas9-sgRNA RNP 복합체를 dsDNA 혹은 ssDNA 형태의 HDR template와 함께 electroporation하면 바이러스를
이용하지 않고도 세포 독성을 최소화하여 효율적으로 T 세포를 교정 할 수 있음을 확인하였다 (Roth
et al. 2018).
Highlighted products - Drug discovery
Genome-wide knockout 스크리닝은 종양 치료를 위한 신약 후보 물질을 탐색하기 위한 효과적인 방법으로, 이를 위해서는 다양한 유전자가 knockout된 세포군이 필요하다. 이를 위해, sgRNA library가 포함된 Lentivirus를 제작하여 낮은 MOI로 Cas9을 발현하는 세포에 감염시켜, 모든 세포가 각각의 sgRNA를 이용해 특정 유전자를 knockout하도록 한다. 이어서, Knockout된 세포 집단을 선택한 변수에 노출시킨 후, reference control의 세포 집단과 비교하여 NGS 분석을 진행함으로써, 특정 유전자의 knockout이 유발하는 표현형 변화를 모니터링할 수 있다.
Guide-it™ CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System을 이용하면, Lentiviral sgRNA library pool을 이용해 human genome에 대한 knockout 스크리닝을 진행할 수 있고, 이를 통해 암 치료를 위한 신약 후보 물질을 발견하는데 사용할 수 있다 (그림 1). 제품 내에는 최신의 알고리즘인 Brunello library에 기반한 sgRNA library가 포함되어 있다. 각 유전자를 타겟으로 하는 4개의 sgRNA와 negative control을 포함하여, 총 76,610개의 sgRNA, 즉, 19,114개의 유전자를 knockout할 수 있다.
그림 1. 6-thioguanine 저항성을 확인하기 위한 pooled sgRNA library 스크리닝 실험 개요
[원문] Gene editing for cancer therapy/drug discovery
[참고문헌]
- Doench J. G.
et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.
Nat. Biotechnol. 34, 184-191 (2016).
- Doench J. G.
et al. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.
Nat. Rev. Genet. 19, 67-80 (2018).
- Kagoya Y.
et al. DOT1L inhibition attenuates graft-versus-host disease by allogeneic T cells in adoptive immunotherapy models.
Nat. Communications 9, 1915 (2018).
- Lao Y. H.
et al. HPV Oncogene Manipulation Using Nonvirally Delivered CRISPR/Cas9 or Natronobacterium gregoryi Argonaute.
Adv. Sci. 1700540 (2018).
- Moses C.
et al. Hallmarks of cancer: The CRISPR generation.
Eur. J. Cancer 93, 10-18 (2018).
- Roth, T. L.
et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.
Nat. Lett. 559, 405-409 (2018).
