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분비 단백질의 대량 생산에 최적

Brevibacillus 분비 발현 시스템

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
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내용
Brevibacillus Expression System II (TaKaRa Code HB200)
· 발현 vector
pNY326 DNA (TaKaRa Code HB111)* 10 ㎍
pNCMO2 DNA (TaKaRa Code HB112)* 10 ㎍
· Control vector
pNY326-BLA DNA (TaKaRa Code HB114)* 1 ㎍
· Competent cell
Brevibacillus Competent-Cells (TaKaRa Code HB116)* 100 ㎕×10
*별도구매 시 제품코드
보존
Expression vector pNY326 DNA, pNCMO2 DNA -20℃
Control vector pNY326-BLA DNA -20℃
Competent cell Brevibacillus Competent-Cells -80℃
His tag 융합 발현 vector pNC-HisT DNA, pNC-HisF DNA, pNC-HisE DNA -20℃
제품설명
Brevibacillus (Bacillus brevis) 발현 시스템은 고효율 분비 발현을 특징으로 하는 단백질 생산능력이 뛰어난 시스템이다. 본 균은 그람 양성의 세균으로 단백질을 대량으로 분비 생산하는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 살려 지금까지 다수의 이종 단백질 생산에 성공해 왔다. 본 시스템에는 아래와 같은 특징이 있다.
  • 대량의 단백질을 균체 외로 분비 생산한다.
  • protease 활성을 거의 나타내지 않는다.
  • 활성형의 단백질을 생산한다.
  • 배양, 멸균이 용이하다.
  • 유전자 조작이 간단하다.
  • 안전한 숙주를 사용한다.

본 시스템을 이용해 효소, 항원, cytokine 등을 고발현시켰을 때 모두 활성이 있는 것을 확인하였다. 또한, 박테리아, 고세균, 진핵생물 유래의 단백질 생산에도 적용할 수 있으며, 유전자의 유래와 관계없이 높은 효율을 나타내고 있다. 특히, 진핵생물 유래의 분비 단백질은 통상 S-S 결합을 포함하는 구조를 가지고 있어, 다른 원핵생물의 발현계에서는 일반적으로 생산이 어렵지만, 본 시스템을 이용하면 분비 생산이라고 하는 특징으로부터 S-S 결합을 가지는 단백질에서도 효율적으로 생산할 수 있는 것이 확인되고 있다.

본 숙주는 형질 전환 효율이 높기 때문에 유전자 조작을 간단하게 실시할 수 있다. 대장균 shuttle vector를 이용하여 발현벡터를 대장균 내에서 구축하거나 ligation DNA를 직접 발현숙주에 도입할 수 있다. System II 에서는 형질전환에 특별한 장치가 필요없는 Brevibacillus Compertent Cells을 사용한다. 시험관이나 플라스크를 이용한 진탕 배양한 후 배양상등액을 원심분리하여 간단하게 목적 단백질을 얻을 수 있다. 균체를 파쇄하지 않기 때문에 원심분리에 의해 균체만 제거하는 간단한 과정으로 맑고 깨끗한 상등액으로부터 목적 단백질을 얻을 수 있고, 이후 정제 과정이 편리하다.
Brevibacillus 발현 시스템의 개요
1. 발현 vector의 선택
(1) pNCMO2 DNA
pNCMO2는 Brevibacillus와 대장균의 shuttle vector로 대장균 내에서 발현시키 고자 하는 유전자가 포함된 plasmid를 구축한 후, Brevibacillus에 도입하여 발현 실험에 이용할 수 있다. pNCMO2의 expression promoter에는 숙주의 세포벽 단백질 유래의 P2 promoter를 이용하고 있다. P2 promoter는 대장균내에서는 작동하지 않아 목적 유전자의 cloning에 유리하다. 반면, Brevibacillus 내에서는 매우 강한 promoter로 작동하므로 효율적인 단백질 생산에 최적이다.
간혹 강력한 promoter 활성으로 인해 형질 전환체의 생육을 방해하는 경우가 있으므로 이러한 경우에는 pNY326 vector의 사용을 검토한다.
pNCMO2 DNA 의 구조


(2) pNY326 DNA
pNY326는 Brevibacillus 내에서 복제 가능한 plasmid로 크기가 비교적 작고(3.4 kb), pNCMO2보다 promoter 활성이 약해 숙주에서 매우 안정적으로 유전자발현이 유지되므로, 발현산물이 숙주에 악영향을 미치는 경우 효과적이다. 이 vector를 이용하는 것으로 양호한 생육을 나타내며 생산량이 향상하는 경우도 있으며, 생산량의 변동이 적기 때문에 대규모의 배양에 적합하다.
Brevibacillus 전용 vector로 Brevibacillus에서 직접 cloning 해야 한다. 높은 형질 전환 효율이 요구되기 때문에, 고효율의 Bevibacillus competent cells의 이용을 추천한다.
pNY326 DNA 의 구조


2. 발현 vector에의 cloning
발현 vector에는 세포벽 단백질 유래의 분비 시그널이 포함되어 있어 분비 시그널의 절단부위 하류에 목적 유전자를 삽입하도록 설계한다. signal peptide 및 하류의 MCS에 2 종류의 제한 효소 부위를 이용하여 insert를 목적 방향으로 cloning 할 수 있다.

3. Brevibacillus의 형질전환
Brevibacillus Competent Cells을 이용해 형질전환하여 neomycin 으로 선별한다. shuttle vector를 이용해서 대장균으로 서브 cloning할 경우에는 ampicillin 내성유전자로 선별한다.

4. 단백질 생산 확인과 스케일 업
Negative control과 positive control (pNCMO2-BLA : Bacillus licheniformis 유래α-amylase)을 이용해 목적 단백질의 발현을 확인한다. 목적 단백질을 발현하는 plasmid를 도입한 형질전환체를 선별하여 정해진 액체배지에 48~64 시간 진탕배양하는 것으로 목적단백질을 회수할 수 있다. 배양상등액을 SDS-PAGE 등으로 해석하여 단백질 발현 유무를 확인할 수 있다. 단백질발현 유무를 확인한 후에는 생산량을 높이도록 배양량을 늘린다.
Brevibacillus His tag 융합 분비 발현 vector
pNC-HisT DNA, pNC-HisF DNA, pNC-HisE DNA는 모두 Brevibacillus와 대장균의 shuttle vector인 한편 분비 발현용 vector인 pNCMO2 DNA (TaKaRa Code HB112)를 부분적으로 변형한 vector이다. pNCMO2의 분비 시그널 하류에 His-tag 서열 (6×His 서열)과 tag의 제거를 위한 protease 인식 서열이 삽입된 구조이다. pNCMO2와 같이 대장균 내에서 유전자를 포함하는 plasmid 를 구축한 후 Brevibacillus에 삽입하여 단백질 발현 실험을 진행할 수 있다.
His tag 서열 뒤에 pNC-HisT DNA는 Thrombin 서열이, pNC-HisF DNA는 Factor Xa 서열이, pNC-HisE DNA는 Enterokinase 서열이 포함되어 있어 목적 단백질에 맞는 최적의 vector를 선택할 수 있다.
발현 promoter에는 pNCMO2와 같이 숙주 세포벽 단백질 유래의 P2 promoter 를 이용하고 있다. P2promoter는 대장균 내에서는 작동하지 않아 목적 유전자의 cloning에 유리하다. 반면, Brevibacillus 내에서는 매우 강한 promoter로 작동하므로 효율적인 단백질 생산에 최적이다.
간혹 강력한 promoter 활성으로 인해 형질 전환체의 생육을 방해하는 경우가 있으므로 이러한 경우에는 pNY326 vector (TaKaRa Code HB111)의 사용을 검토한다. (단, N-말단에의 His-tag 도입은 할 수 없다.)


그림. B. choshinensis 발현 vector의 구축
pNC-His DNA 구조


사용상의 주의
Brevibacillus 발현 시스템 관련 제품은 Higeta Shoyu 사가 개발· 제조하고 Takara Bio가 판매하고 있습니다. 본 제품은 연구 목적에게만 사용이 허가되고 있으며, 제품 구입 시 라이선스 동의서를 작성해야 합니다. 라이선스에 관한 질문은 다카라코리아 (02-2081-2510)로 문의 바랍니다.

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