■ Introduction
많은 부모들은 갓 태어난 아기에게서 갑자기 알 수 없는 발진이 생기는 경험을 한다. 신생아의 피부는 극도로 예민하여 이것을 처음 보는 부모들은 아기의 안색이 붉은색, 하얀색, 갈색, 노란색 또는 분홍색 등 다양한 색깔로 표출되며 이것들이 점을 이뤄 발진으로 변할 수 있다는 사실을 발견하고 놀랄 수 있다. 대부분은 세탁 세제, 신생아의 정상적인 호르몬 변화, 열 또는 기저귀로 인한 피부 자극과 같은 단순한 원인에 의해 발생되며 이러한 발진은 발생하자 마자 빠르게 사라진다.

그러나 백만명 중 한 명은 무해한 단순 발진이 아니라, 만성 영아 신경 피부 관절 증후군 (Chronic Infantile Neurologic Cutaneous and Articular syndrome, CINCA)이라고도 불리는 신생아 발현 다발성 염증 질환 (Neonatal-Onset Multisystem Inflammatory Disease, NOMID)의 전조 증상인 경우가 있다.

■ Discussion
What is NOMID?
NOMID는 Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes (CAPS)에 해당하는 질병 계통 중 가장 심각한 질환으로 알려져 있다. 모든 CAPS 질환은 cryopyrin을 암호화하는 NLRP3의 돌연변이를 포함하는데, Cryopyrin은 NOD와 같은 수용체로, 환경에 존재하는 감염원에 대한 신체의 선천적인 면역반응에 중요한 요소 중 하나이다. 이 수용체는 oligo를 이뤄 ASC 및 pro-caspase-1과 상호작용하여 Interleukin-1 beta (IL-1 beta) 생산에 영향을 미치는 인플라마솜 (inflammasome)을 형성한다. IL-1 beta는 신체가 스스로를 보호하기 위한 염증성 NLRP3 인플라마솜 반응을 매개한다.


■ Conclusions
Bringing clarity to ambiguous cases
그렇다면 그 방법은 얼마나 효과적이었을까? 이 기술을 돌연변이 음성 NOMID 환자 10명의 샘플에 적용했을 때, 10명 중 4명에서 체세포 모자이크가 확인되었다. 확인된 돌연변이 중 하나 (p.Phe302Leu)가 새롭게 발견되었으며, 두 가지 다른 세포 기반 분석을 통해 병원성이 확인되었다. 저자는 이론적으로 약 10시간 동안 단일 454 GS-FLX에서 최대 100개의 환자 샘플을 분석할 수 있도록 하며 “각 amplicon의 가닥에 대해 약 350개의 read depth는 통계적 신뢰도가 1% 보다 낮은 체세포 모자이크를 탐지하기에 충분할 것” 이라고 결론지었다.

More than NOMID
중요한 것은 이러한 연구가 NOMID/CINCA에 국한되지 않고 종양 분석과 같이 낮은 빈도로 발견되는 체세포 모자이크가 역할을 하는 다른 상황에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 또한, 파킨슨병에서 체세포 alpha-synuclein 돌연변이를 조사하는 과학자들에 의해 Izawa 등의 연구가 인용되었다 (Prooukakis et al. 2013). 이러한 방법이 이전에 다루기 어려웠던 분자 분석을 조명한다면, 단백질 번역관련 연구자, 임상의 및 환자가 현재 직면하고 있는 가장 어려운 생물 의학 문제 중 일부에게 희망이 될 잠재력이 있을 것이다.

■ Methods
Massively parallel sequencing to analyze somatic mosaicism
본 방법은 교토 약학 대학, RIKEN 알레르기 및 면역 연구소, 교토 대학 iPS cell 연구센터, NIH의 자가면역질환 연구부서 등에서 연구하는 연구자들의 논문에 의해 알려졌다. 공동 제1저자인 Kazushi Izawa 와 Atsushi Hijikata, 공동 저자인 Ryuta Nishikomori와 Osamu Ohara를 포함해 여러 분야에 걸친 과학자 그룹에서 ‘돌연변이 음성 NOMID’ 환자를 분석하기 위해 차세대 염기서열 분석기법 (NGS)을 적용하기로 하였다. 그러나 주요 관심사는 NGS 데이터에 내재된 noise 중 낮은 수준으로 존재하는 대립유전자를 식별할 때 통계적 유의성을 가질 수 있는 지 여부였다. 그래서 저자들은 전체 NLRP3 코딩 영역을 증폭하는 14개 PCR 산물의 error map을 구성하는 것으로 연구를 시작했다. 그들의 데이터에는 체세포 모자이크가 없는 것으로 생각되는 50개의 대조 검체에서 약 100만 개의 판독치가 포함되었다. 이를 이용하여 Roche 454-FLX sequencer로 MPS (Massively Parallel Sequencing)하여 염기서열 오류 패턴을 분석하고 돌연변이 음성 NOMID 환자의 MPS 데이터를 평가할 때 nucleotide 위치 및 DNA 가닥별 오류율을 조정할 수 있었다.
체세포 모자이크 판정을 위한 식별 파이프라인을 가능하게 했기 때문에 error map을 명확히 하는 것이 중요했다. 데이터를 생성하기 위해 저자들은 MPS를 위해 2 step PCR 반응과 pooling library를 사용하였다. NLRP3 코딩 엑손 영역과 근접한 인트론 영역은 14개의 amplicon으로 커버하였고, 이 amplicon을 Roche 454 GS-FLX sequencer (최대 450개 기준)의 평균 read length로 설계한 후, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase로 각 genomic DNA 샘플로부터 증폭하였다. PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase로 다시 수행한 두번째 PCR 증폭에서 3' adaptor 서열과 5' MID (Multiplex Identifier) tag를 추가한 후 Roche 454 GS-FLX sequencer로 multiplex sequencing 하였다.

■ Reference
Izawa, et al., Detection of base substitution- type somatic mosaicism of the NLRP3 gene with >99.9% statistical confidence by massively parallel sequencing. DNA Res. 19(2):143–152 (2012).
Proukakis, et al., Somatic alpha-synuclein mutations in Parkinson's disease: Hypothesis and preliminary data. Mov. Disord., 28:705–712 (2013).

본 연구에 사용된 high fidelity PCR 효소 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase 확인하기