1시간 이내에 완료하는 Colony PCR
1시간 이내에 완료하는 Colony PCR
빠르고 간편한 colony PCR 프로토콜 제공
- 간단한 PCR 셋업 : primer와 cell을 master mix에 추가
- 시간 절약 : loading dye가 포함되어 있어 PCR 산물을 gel에 바로 loading
- 간편한 제한효소 처리 : gel purification 또는 buffer 교환 없이 PCR 반응액에 바로 적용
- 짧은 반응 시간 : 단 60분 만에 최대 2 kb의 insert를 확인 가능
- 최적의 cloning solution 제공 : In-Fusion® cloning 시스템과 함께 사용하면 신속한 스크리닝 후 빠르고 정확하게 cloning이 가능
■ Overview
Colony PCR은 배양 또는 플라스미드 정제 단계 없이 bacteria colony에서 직접 원하는 insert를 포함하는 플라스미드를 스크리닝하는 데 사용되는 방법이다. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Code RR350A)를 사용하면 아래 세 가지 기본 프로세스만으로 colony PCR 워크플로우를 더욱 개선할 수 있다.
1. Colony를 picking
2. 새로운 plate에 접종하여 replica plate를 만들고
3. Suspended E. coli를 주형으로 사용하여 fast PCR 수행
그림 1. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix를 사용한 colony PCR 프로토콜.
■ Results
SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Code RR350A)로 빠르고 간편한 colony PCR 가능
SapphireAmp® Fast PCR Master Mix는 extension 속도가 10초/kb로 진행되며, 기존 Taq polymerase를 사용한 시간의 절반만으로 반응을 완료할 수 있다. SapphireAmp® master mix는 타사의 dye plus premix보다 PCR 속도가 훨씬 빠르며, 아래 표에는 SapphireAmp® master mix의 반응 시간과 타사의 두 가지 dye plus premix의 권장 반응 시간을 확인할 수 있다
|
Amplicon length |
SapphireAmp Fast PCR Master Mix |
P사 dye-added master mix |
T사 dye-added master mix |
|
0.5 kb |
50 분 |
1 시간 35 분 |
1 시간 30 분 |
|
1.0 kb |
55 분 |
1 시간 50 분 |
1 시간 45 분 |
|
2.0 kb |
1 시간 |
2 시간 20 분 |
2 시간 15 분 |
|
4.0 kb |
1 시간 30 분 |
3 시간 20 분 |
3 시간 15 분 |
실험 예: SapphireAmp® Fast PCR Master Mix를 사용하여 colony PCR로 cDNA 라이브러리 스크리닝
Mouse cDNA library (insert size : 0.5-5 kb)를 삽입한 pUC118를 E. coli에 transformation하였다. 이후 플라스미드를 가진 형질전환체를 SapphireAmp® Fast PCR Master Mix와 M13 Primer M4 (종매) 및 M13 Primer RV (종매)를 사용하여 PCR 하였다 (아래 방법 참고). 그 결과, PCR 반응은 단 70분 만에 고수율로 완료되었고, 확인된 16개 clone은 모두 0.5-5 kb insert를 포함하는 것을 확인하였다.
그림 2. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix를 이용한 colony PCR
■ Methods
ㆍ PCR master mix는 다음 구성요소와 함께 준비한다.
|
구성요소 |
용량 (반응당) |
|
SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (2X Premix) |
25 ㎕ |
|
M13 Primer M4 (20 µM) |
0.5 μM |
|
M13 Primer RV (20 µM) |
0.5 μM |
|
dH2O |
최대 24 ㎕ |
|
합계 |
50 ㎕ |
멸균된 피펫 tip을 이용하여 colony의 소량만 PCR master mix에 풀어주고 Takara PCR Thermal Cycler Dice (Code TP600, 종매)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
위 조건으로 PCR을 완료한 후, 각 반응 산물 5 ㎕를 agarose gel에서 전기영동하였다.
ㆍ PCR 조건
