■ Introduction
GC 함량이 높은 주형을 사용하는 경우 간혹 2차 구조를 형성하거나, 높은 melting temperature을 필요로 하여 PCR 반응이 저해될 수 있다. PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Code R050A)는 까다로운 조건의 주형을 효율적으로 증폭할 수 있는 high-fidelity PCR 효소이다. 이 효소를 사용하면 반응 조건의 별도의 최적화나 DMSO 또는 Betaine 같은 첨가제를 쓰지 않고도 GC 함량이 높은 주형을 증폭할 수 있다.

이 실험에서는 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase를 GC 함량이 높은 타겟을 증폭할 수 있는 타사의 효소와 비교하였다. 비교 결과, PrimeSTAR^® GXL 효소만이 첨가물이나 특별한 반응 조건의 설정 없이도 GC 함량이 높은 주형을 효율적으로 증폭할 수 있었다.

■ Results
표준 반응 조건에서 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase만 예상 크기의 단일 증폭 산물을 생성하였고 (그림 1), 타사 효소의 경우 DMSO (최종농도 5%) 와 Betaine (최종농도 1 M)이 첨가된 반응에서만 PCR 산물을 얻을 수 있었다 (그림 2, 왼쪽). PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase의 경우 이러한 첨가제가 있을 때는 증폭된 산물이 거의 없었다 (그림 2, 오른쪽).

그림 1. 표준 반응 조건에서 얻은 증폭 산물 (약 603 bp).
Pfu : Pfu 중합효소, Co. A : A사 master mix, Co. D : D사 master mix, PS: PrimeSTAR^® GXL polymerase


그림 2. DMSO 및 Betaine을 포함하는 반응에서 얻은 증폭 산물 (약 603 bp).
Pfu : Pfu 중합효소, Co. A : A사 master mix, Co. D : D사 master mix, PS: PrimeSTAR^® GXL polymeras

■ Conclusions
본 실험에서는 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase가 유일하게 첨가제 없이 GC 함량이 75% 이상인 주형 DNA 서열을 증폭할 수 있는 PCR 효소임을 확인하였다. PrimeSTAR^® GXL DNA polymerase는 특별한 반응 조건 검토나 증폭 효율을 높이기 위한 첨가제 없이 타겟을 증폭할 수 있었다 (표준 2-step PCR 프로토콜 사용). 반면 타사 효소는 DMSO와 Betaine이 반응에 첨가되었을 때만 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 통해 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase가 GC 함량이 높은 타겟에 최적화가 필요 없는 PCR 증폭에 이상적임을 확인할 수 있었다.

■ Methods
CEBPA 유전자 프로모터에 75.29% GC contents를 가진 영역 (603 bp)을 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase, A사 master mix, D사 master mix, Pfu DNA polymerase을 사용하여 human genome DNA (K562 세포주에서 정제)에서 증폭하였다. 제조사의 권장 사항에 따라 반응을 진행하였으며, 모든 반응은 아래 표 1의 cycling 조건에 따라 실행하였다 (MultiGene Thermal Cycler (Labnet) 사용). 이후, 증폭된 산물을 gel 전기영동으로 분석하였다.

Table 1. PCR cycling 조건
PrimeSTAR GXL polymerase (2-step PCR)			A사, D사, Pfu polymerase (3-step PCR)
98°C	10초	35 cycles	95°C	30 초	35 cycles
			60°C	15 초
68°C	20 초
			72°C	30 초