Q1. 증폭 산물을 얻지 못했을 때 검토할 수 있는 요소는 무엇인가요?
[일반적인 유의사항]

• PCR 반응에 필요한 반응물을 모두 넣었는지 확인합니다. 모든 구성요소를 넣었는지, 그리고 모든 구성요소가 정상적으로 반응을 했는지를 확인하기 위해서는 positive control을 항상 포함시킵니다.
• 실험 조건에 문제가 없었다면 PCR cycle을 최대 40 cycle (한 번에 3-5 cycles)까지 늘리면 주형이 부족한 문제를 해결할 수 있습니다. 또한 cycle 수를 늘리면 primer 불순물이나 낮은 priming 효율로 인한 template inaccessibility 문제를 해결할 수 있습니다.
• Cycle 수를 늘려도 문제가 개선되지 않는다면 특정 primer set 또는 주형 DNA에 대해 너무 까다로운 조건일 수 있습니다. 다음과 같이 PCR 조건을 수정하는 것이 좋습니다.
  - Annealing 온도를 2℃씩 낮춥니다.
  - Extension 시간을 늘립니다.
  - Template 양을 늘립니다. 각 효소의 가이드라인에 따라 최적의 주형 DNA 양을 검토합니다.

[PCR이 잘 되지 않는다면 다음과 같은 사항을 검토하세요]

• 샘플에 PCR 저해성분 포함여부
  샘플에 PCR을 저해하는 물질이 포함되어 있는 경우, 주형을 희석하여 사용하면 PCR 효율을 높일 수 있습니다. 또는 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (Code 9761) 등의 PCR Clean-Up 제품을 사용하여 주형을 정제하거나, 주형을 정제하기 어려운 경우에는 MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3 (Code R076) 같이 PCR 저해물질에 내성이 높은 효소를 사용하여 PCR 결과를 개선할 수 있습니다.
• 주형의 높은 GC 함량 (65% 이상)
  GC 함량이 높은 조건에 적합한 효소를 사용하는 것이 좋습니다. 적절한 효소를 찾기 위해 Takara PCR 효소 선택 가이드를 참고하세요.
• Primer 적합성
  성공적인 PCR을 위해 primer 선택은 매우 중요합니다. Primer가 적합하지 않을 때는 다시 디자인하는 것이 좋습니다. 또한 경우에 따라 첫번째 PCR 산물을 10배씩 희석 (1:100~1:10,000)한 후 nested primer를 디자인하여 재증폭하는 방법도 적용해 볼 수 있습니다.

Q2. 비특이적 밴드가 있을 때, 특이성을 향상시키기 위해 무엇을 할 수 있습니까?
[일반적인 PCR 효소]
문제점 : 특이성이 낮은 primer   
해결방안 : BLAST alignment를 이용하여 primer의 3’ 말단이 타겟 사이트보다 타겟 이외의 부위에 상보적인지 확인합니다. 타겟 이외의 부위에 상보적인 서열이 있다면 primer를 다시 디자인하거나 PCR 조건을 수정하는 것이 좋습니다.

문제점 : 적합하지 않은 PCR 조건
해결방안 :

• Annealing 온도를 2℃씩 올립니다.
• Touchdown PCR을 사용합니다.
• Two-step PCR 프로토콜을 사용합니다.
• PCR cycles 수를 낮춥니다.

문제점 : 실험에 사용된 주형 DNA의 양이 너무 많을 때
해결방안 : 주형의 양을 2~5배 정도 줄입니다.

[PrimeSTAR^® HS & PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase]
문제점 : Annealing 시간이 너무 길 때
해결방안 : 타겟을 특이적으로 증폭하기 위해서는 3 step PCR을 수행할 때, annealing 시간을 5-15 초로 짧게 진행하는 것이 중요합니다.

[PrimeSTAR^® GXL DNA polymerases]
문제점 : Primer의 Tm 값이 적합하지 않을 경우
해결방안 : 1kb 이하의 타겟을 증폭하려면 Tm 값이 55℃ 이상이 되도록 primer를 디자인하고, annealing 온도를 60℃로 반응합니다. Tm 값이 55℃ 이하인 primer는 extension 시간을 5~10 초/kb로 짧게 진행합니다.

[TaKaRa Ex Taq^® & TaKaRa LA Taq^®]
문제점 : 저온에서 비특이적인 primer annealing
해결방안 : 각 효소의 hot-start version을 사용하여 일부 primer에서의 결과를 향상시킬 수 있습니다.

Q3. PCR 산물을 로딩한 gel에 smear 현상이 있습니다. 결과를 어떻게 개선할 수 있나요?
Positive control 및 negative control (주형 DNA 없음)에 smear 현상이 있는지 확인합니다. 이를 통해 smear 원인이 오염이나 overcycling, 또는 잘못 디자인된 primer나 PCR 조건이 맞지 않아 발생한 것인지 확인할 수 있습니다.

Negative control에서 smear 현상이 보이지 않는다면 오염이 없는 것입니다. 이 경우 PCR 조건의 최적화를 위해 다음 사항을 검토하세요.

• 주형의 양을 줄입니다.
• Annealing 온도를 높입니다.
• Touchdown PCR을 사용합니다.
• PCR cycle 수를 줄입니다.
• Primer를 다시 디자인합니다.
• Nested primer를 사용합니다.
• PCR 산물을 다시 증폭합니다 (전기영동한 gel을 마이크로 피펫 tip으로 작게 잘라 물 200㎕에 넣고 37 °C에 두면 DNA를 회수할 수 있습니다. DNA 회수 용액의 5 ㎕를 재증폭을 위한 PCR 주형으로 사용할 수 있습니다).

반면 negative control에 smear 현상이 있다면 오염을 의심할 수 있습니다. 오염의 원인을 파악하기 위해 PCR 시약을 교체하고 피펫과 실험대에서 오염요소를 제거할 필요가 있습니다 (오염에 대한 자세한 내용은 아래 내용 참조하세요).

Q4. PCR 오염의 주된 원인은 무엇인가요?
1. 가장 일반적인 오염원은 이전에 증폭된 PCR 산물입니다 (carryover contamination이라고 함). 다량의 PCR 산물 (10¹² molecules)이 일정 시간에 걸쳐 반복적으로 생성되면 오염 가능성이 더 높아집니다.
2. 또 다른 오염원은 실험실에서 이전에 다뤘던 DNA입니다.
3. 샘플 간의 오염이 발생할 수 있는데, 증폭 전에 다양한 처리가 필요한 샘플에서 가장 많이 일어납니다.
4. PCR 반응액, 그리고 실험실 장비와 시약 등에 존재할 수 있는 DNA를 포함하여 외부에 존재하는 DNA에 의해 오염이 발생할 수 있습니다.

Q5. 오염을 어떻게 예방할 수 있나요?
민감도 높은 PCR을 위해서는 샘플이 외부 DNA 또는 실험실 환경에서 이전에 증폭된 산물 등으로 오염되지 않게 주의해야 합니다. PCR 전에 샘플을 준비하는 공간과 PCR 후 분석하는 공간을 분리하는 것이 좋습니다. 

UV 램프가 장착된 클린벤치에서 PCR 반응액을 준비하는 것을 권장합니다. 다음과 같이 서로 분리된 공간에서 실험하는 것이 좋습니다.

• PCR 반응을 위해 샘플을 준비하는 pre-PCR과 PCR 이후의 post-PCR 공간을 구분합니다.
• PCR, PCR로 증폭된 DNA 정제, DNA 농도 측정, agarose gel 실행, PCR 산물 분석에 사용되는 post-PCR 공간을 정합니다.

장비 또한 영역을 구분하여 배치합니다. PCR 장비와 전기영동 장치는 post-PCR 공간에 배치합니다.
DNA 샘플 및 PCR 반응액 준비 전용 피펫과 에어로졸 필터가 있는 tip을 사용하는 것이 좋습니다. 추가 권장사항은 다음과 같습니다.

• Pre-PCR 및 post-PCR을 위한 별도의 피펫과 tip 세트, 실험복, 실험 장갑 및 폐기물 바구니를 배치합니다.
• Pre-PCR 및 post-PCR 실험기구에 라벨링하여 지정된 실험대를 벗어나지 않도록 합니다.
• PCR golden rule 준수 : post-PCR 공간에서 사용된 시약, 장비, 피펫을 pre-PCR 공간으로 다시 가져오지 않도록 합니다.
• PCR용 시약을 별도로 준비하여 보관하고 지정된 용도로만 사용합니다. 시약은 pre-PCR에 사용되는지, post-PCR에 사용되는지에 따라 소량씩 나누어 각 공간에서 보관합니다. 구분된 시약은 다른 DNA 샘플과 별도로 보관해야 합니다.

오염 유무를 확인하기 위해 주형 DNA가 없는 negative control을 항상 같이 진행합니다. 높은 감도가 필요한 분석일수록 오염의 영향을 받기 쉽기 때문에 PCR cycle 수를 최소한으로 시행하는 것이 좋습니다.

Q6. PCR 오염이 있는 경우 어떻게 오염을 제거할 수 있나요?
1. Cell culture hood에서 UV 램프를 이용하여 피펫을 overnight으로 소독합니다. UV는 thymidine 잔기의 cross-linking을 촉진하고, 잔류하는 DNA를 제거합니다.
2. 실험대/장비/피펫에 DNA-OFF^® (Code 9036)를 처리한 다음 깨끗이 닦으십시오.
3. 실험대 변경 : pre-PCR 공간을 사전에 소독된 다른 공간으로 이동합니다.
4. 이전에 사용했던 기구나 피펫을 사용하지 않도록 합니다.

Q7. PCR error가 발생하면 어떻게 해야 하나요?
PCR error를 줄이기 위해서는 high-fidelity 효소를 사용할 것을 권장합니다 (PrimeSTAR^® 시리즈 참조). 또한 다음 주의사항을 확인해주세요.
1. PCR 반응에서 overcycling

• 반응액의 pH를 바꿔 DNA를 불안정하게 합니다.
• PCR 산물의 양을 증가시켜, polymerase의 증폭 효율을 감소시키고 PCR error를 발생시킵니다.
• dNTP 양을 감소시켜, 불균형한 dNTP 농도로 인해 염기가 잘못 혼입될 가능성이 높아집니다 (다카라의 PCR 효소는 dNTP 농도 200 nM에 최적화되어 있으며, dNTP 농도를 높이면 잘못된 염기 편입 (misincorporation)이 발생할 수 있습니다).
• 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA의 축적을 유발합니다.

2. 높은 Mg²⁺ 농도
Mg²⁺ 농도 범위는 1-5 mM이며, 항상 dNTP 농도보다 높아야 합니다. 높은 Mg²⁺ 농도는 증폭 산물의 수율을 증가시킬 수 있지만 효소의 proofreading 활성에 영향을 줄 수 있습니다.  

3. 주형 DNA 손상
Gel에서 PCR 산물을 확인하거나 DNA 밴드를 잘라낼 때 UV 노출 시간을 최소화하는 것을 권장합니다.

Q8. PCR 저해물질이란 무엇인가요?
PCR 증폭을 방해하는 불순물을 PCR 저해물질이라고 합니다. 이는 매우 다양한 종류의 샘플에 존재하며 PCR 민감도를 감소시키고 false-negative PCR 결과를 야기할 수 있습니다. PCR 저해물질은 무기물과 유기물 모두에서 유래할 수 있습니다 (Schrader 2012).

무기물 PCR 저해물질은 다음을 포합니다.

• 칼슘 또는 기타 금속 이온 : 마그네슘 (Mg²⁺⁾과 경쟁
• EDTA : 마그네슘 (Mg²⁺)과 결합하여 농도를 감소시킴

일부 유기물 PCR 저해물질은 다음을 포함합니다.

• 다당류 및 당지질 : 핵산구조를 모방하여 주형과 primer의 결합을 방해
• 멜라닌과 콜라겐 : DNA polymerase와 가역적 복합체를 형성함
• 휴믹산 (humic acids) : 낮은 농도로도 주형 DNA 및 polymerase와 상호작용하여 효소 반응을 억제시킬 수 있음
• 요소 (urea) : polymerase를 분해함

PCR을 억제할 수 있는 다른 유기 화합물은 다음과 같습니다.

• 혈액, 혈청, 혈장 샘플의 헤모글로빈, 락토페린 및 IgG
• 헤파린과 같은 항응고제
• 식물의 polyphenols, pectin, xylene
• Ethanol, isopropyl alcohol, phenol, SDS와 같은 계면활성제

샘플에 PCR 저해물질이 있는 경우, 주형을 100배 희석하면 저해제도 같이 희석되므로 PCR 증폭이 가능할 수 있습니다. 또는 주형 샘플을 ethanol 침전하면 저해물질로 인한 PCR 효율 감소를 개선할 수 있습니다.

References
Schrader, C., et al. PCR inhibitors-occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113:1014-1026 (2012).

Q9. PCR overcycling이 무엇인가요? PCR 산물이 overcycling 되었는지 어떻게 알 수 있나요?
PCR overcycling은 cycling이 exponential phase를 넘어서는 경우를 뜻하며 다음과 같은 경우에 나타납니다.

• 기질 (dNTP 또는 primer )의 고갈
• 시약 (dNTP 또는 효소)이 denaturation 온도에서 더 이상 안정적이지 않을 때
• Pyrophosphate, duplex DNA 등의 생성물로 인해 PCR 효소가 억제될 때   
• 비특이적인 증폭산물과 시약 (dNTP 및 primer 등)이 경쟁하는 상황
• 반응액의 pH가 낮아졌을 때
• 반응 산물의 농도가 높아 denaturation/strand 분리가 불완전할 때

PCR overcycling이 일어난 경우 agarose gel에서 밴드 구분이 어려운 background smear가 나타납니다. 조건 검토를 수행하여, PCR 산물을 충분히 생산하기 위한 최소의 PCR cycle 수를 결정하는 것이 좋습니다. 증폭산물이 3-5 cycle마다 급격히 증가하면 비특이적인 DNA의 증폭이 일어나게 됩니다. Overcycling된 cDNA는 downstream application에 적합한 주형 DNA를 생성하지 못하는 것으로 나타났습니다.

Q10. PCR로 인해 발생할 수 있는 mutation 타입은 무엇인가요?
PCR polymerase는 단일 염기 치환, 결실, 삽입을 포함한 다양한 mutation을 유발할 수 있습니다. 염기 치환은 일반적으로 DNA 합성 중에 잘못된 dNTP가 결합되어 발생합니다.

Polymerase는 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실되거나 삽입된 위치에서 error를 유발할 수 있습니다. 이러한 타입의 mutation 빈도는 서열에 따라 다를 수 있으며, 반복되는 서열에서 더 높게 나타납니다. 가장 일반적인 mutation은 단일 뉴클레오티드의 결실이며, 이는 반복적인 homopolymeric 서열 내에서 주형 DNA-primer의 misalignment에 의해 일어날 수 있습니다. DNA rearrangements는 polymerase가 하나의 DNA 가닥에서 합성을 종료하고, 상보적인 가닥에 priming 후 합성을 계속하면서 발생합니다 (strand-switching 또는 jumping PCR). 이러한 타입의 mutation은 DNA의 서로 다른 영역 사이에 높은 상동성이 있을 때 발생합니다. 이러한 반응에서 주형 DNA가 너무 많은 경우 mutation이 더 촉진될 수 있습니다.

Q11. PCR에 의한 mutation을 촉진하는 요인은 무엇인가요?
다음 요인은 PCR에 의한 mutation 가능성을 높일 수 있습니다.

• 불균형한 dNTP 농도
  네 종류의 dNTP 양이 동일하지 않으면 염기 치환이 최대 8배까지 증가할 수 있습니다. 4개의 dNTP를 동일한 농도로 사용하는 것이 polymerase의 오류를 줄이는 데 중요합니다.
• 높은 농도의 효소 사용
• 긴 반응 시간
• 3’->5’ exonuclease 활성 부족
• 마그네슘 (Mg²⁺) 농도
  PCR 효소의 정확도 (fidelity)는 마그네슘 (Mg²⁺)과 dNTP의 농도가 동일할 때 가장 높습니다. 자유 2가 양이온의 농도가 증가하면 PCR 효소의 정확도가 감소합니다.
• 반응액의 pH
  반응액의 pH를 정상 pH 7.4에서 pH 4.4로 낮추면 염기 치환이 최대 60배까지 증가할 수 있습니다. 낮은 pH (<6.0)에서는 퓨린염기가 스스로 탈락되는 현상이 발생할 수 있습니다.
• DNA 손상
  고온에서는 DNA가 손상될 수 있으며, 이로 인해 mutation 빈도가 증가합니다. 가장 흔한 mutation 중 하나가 uracil을 생산하는 cytosine의 탈아미노화 (deamination)입니다.
• Pimer 서열에서 A 염기의 반복
• Overcycling
  마지막 PCR cycle 동안 DNA 농도가 증가하면 오류 발생율이 증가합니다. 오류 없이 원하는 PCR 산물을 생산하기 위해서는 총 cycle 수를 최소한으로 설정하는 것이 좋습니다.

Q12. PCR artifact는 무엇인가요?

• Primer dimers는 primer의 3’ 말단에서 primer 서열들 간의 상보성에 의해 발생합니다. 주형 DNA가 없는 반응 (negative control)에서 PCR 산물이 생성된 경우 primer dimer를 의심할 수 있습니다. Primer dimer를 방지하기 위해 Primer의 3’ 말단에 상보성을 가져서는 안 됩니다. 
  
  
• Chimeric PCR 산물
  주형이 불완전하게 증폭되면 chimeric PCR 산물이 발생할 수 있습니다. Polymerase의 조기반응 종결로 인해 완전히 복제되지 않은 단일 가닥 주형 DNA가 상보적인 주형에 부분적으로 annealing될 수 있습니다. 이 경우, Chimeric PCR 산물이 생성될 수 있습니다. Chimeric 산물을 최소화하려면 가능한 적은 PCR cycle 수로 진행합니다.
  
  
• PCR의 증폭 편향성
  PCR의 증폭 편향성은 PCR primer의 결합 선호도에 따라 특정 서열이 다른 서열보다 더 효과적으로 증폭될 때 발생합니다. 한번의 cycle에서 하나의 염기서열이 다른 서열보다 10% 더 증폭되면 30 cycle 후에는 17.4배나 많아집니다. 이러한 편향성을 줄이려면 denaturation과 annealing 단계 사이에 높은 ramp rate을 사용하고 annealing 온도를 낮게 하는 것이 좋습니다. 또한 긴 extension 시간 (>180 초)은 피해야 합니다.
  
  
• PCR drift
  PCR drift는 특히 주형의 농도가 매우 낮은 초기 cycle에서 PCR 반응액 내의 불균형으로 인해 일어납니다. 이러한 현상은 서로 다른 다수의 primer 세트간의 상호작용으로 감도가 떨어질 수 있는 multiplex 분석에서 관찰됩니다. 이러한 유형의 분석에서는 primer를 신중하게 디자인하는 것이 중요합니다.
  
  
• Agarose gel에서 거의 이동할 수 없는 고분자량의 PCR 산물을 생성
  이 artifact 현상을 정확하게 설명할 방법이 없습니다. 대부분의 연구자들은 PCR 후기 단계에서 단일 가닥 분자와 이중 가닥 분자가 모두 축적되기 때문에, 이러한 현상이 overcycling에 의해 일어난다고 추측합니다. 단일 가닥 분자가 축적되면 primer와 경쟁하여 heteroduplex를 생성할 수 있습니다. 후기 단계에서 PCR 산물의 농도가 높을 때 불완전한 denaturation은 DNA 가닥 분리를 방해하여 새로 형성된 amplicon이 이전에 만든 주형 DNA에 결합된 상태로 남을 수 있습니다. 이 과정이 반복되면 원하지 않는 새로운 산물이 생성될 수 있습니다.
  
  고분자량 smear는 초기 PCR cycle 동안 주형의 부분적인 extension에 의해 발생할 수 있고 이러한 부분적인 extension은 점핑 현상에 의해 일어날 수 있습니다. Primer 또는 단일 가닥 DNA가 주형에 annealing되어 한쪽 priming 사이트에서 extension 한 후에 이 단편이 다른 homologous한 부분에 결합하여 부분적인 annealing을 일으킬 수 있습니다 (위 ’Chimeric PCR 산물’ 참조). 이렇게 부분적으로 extension된 DNA는 free 3’-OH기를 포함하고 있기 때문에 새로운 primer로 기능할 수 있고, 따라서 이는 초기 priming 사이트와 jump 사이트가 결합된 chimeric 분자를 생성시킬 수 있습니다.
  
  마지막으로, 이러한 현상은 crude 샘플을 PCR을 할 경우에도 나타날 수 있습니다. 동·식물 조직에서 직접 증폭된 산물은 cell debris가 혼입되어 gel에서의 이동이 저해됩니다. 이 문제는 증폭된 PCR 산물에 Proteinase K를 처리하여 해결할 수 있습니다. 예를 들어, 전체 50 ㎕ PCR 반응에 Proteinase K가 포함된 loading buffer 15 ㎕를 추가하거나, gel에 샘플을 loading하기 전에 Proteinase K가 포함된 loading buffer 1 ㎕를 PCR 반응액 4 ㎕에 추가하여 전기영동을 진행합니다.